Caracterización de dos activadores transcripcionalesMafR de Enterococcus faecalisy MgaP de Streptococcus pneumoniae

Resumen

Enterococcus faecalis y Streptococcus pneumoniae son bacterias Gram-positivas que pueden colonizar varios nichos del ser humano, bien sea como comensales o como patógenas. Su capacidad de adaptación a nuevos nichos está estrechamente relacionada con la acción de proteínas que funcionan como reguladores globales de la transcripción. Estas proteínas activan y/o reprimen la transcripción de numerosos genes en respuesta a señales ambientales específicas. La familia de reguladores globales conocida como Mga/AtxA incluye varias proteínas de bacterias Gram-positivas: Mga (S. pyogenes), AtxA (Bacillus anthracis), MgaSpn (S. pneumoniae) y MafR (E. faecalis). Nuestro grupo demostró que MafR de E. faecalis V583 genera complejos multiméricos al interaccionar con fragmentos de ADN lineal y que esta interacción tiene poca o ninguna especificidad de secuencia. Además, utilizando microarrays diseñados para E. faecalis OG1RF, se observó que MafR activa la transcripción de al menos 87 genes, muchos de los cuales constituyen operones implicados en la utilización de fuentes de carbono. Por otra parte, se sabía que los genes spr1403 (pclA) y spr1404 (mgaP) de S. pneumoniae R6 constituyen un clúster que está presente sólo en algunos aislados clínicos. Buscando homologías, encontramos que MgaP tiene similitud de secuencia (60.3%) con el regulador MgaSpn de la familia Mga/AtxA. En esta Tesis hemos progresado en la caracterización del regulador MafR de E. faecalis OG1RF y hemos iniciado el estudio de la proteína MgaP de S. pneumoniae R6. Hemos demostrado que MafR de E. faecalis OG1RF forma complejos multiméricos en fragmentos de ADN lineal al igual que lo hace MafR de E. faecalis V583, con la que difiere en cinco aminoácidos, tres de ellos ubicados en el dominio de unión a ADN. Además, hemos demostrado que la eliminación de los tres primeros residuos de MafR conlleva la pérdida de su capacidad de interaccionar con ADN, lo que sugiere que dichos residuos son cruciales para la estructura y/o función de la proteína. Hemos identificado tres genes regulados directamente por MafR, los cuales parecen estar involucrados en el transporte de calcio (OG1RF_12294), en la incorporación de un precursor de la queuosina (OG1RF_11486) y en el transporte de celobiosa (OG1RF_10478), sugiriendo un papel regulador de MafR en estos procesos. MafR activa los promotores de sus genes diana uniéndose a un sitio específico que solapa con la caja -35. Los sitios de unión de MafR muestran una identidad de secuencia baja y están localizados en/entre regiones de posible bendability. Proponemos que MafR reconoce sitios específicos del ADN por un mecanismo que implica el reconocimiento de características estructurales del ADN. Hemos demostrado que el gen mgaP de S. pneumoniae R6 se expresa en condiciones de laboratorio. Su transcripción es mayor en la fase logarítmica del crecimiento bacteriano que en la fase estacionaria. Hemos identificado el promotor del gen mgaP y observado que no parece estar auto-regulado. Utilizando estirpes de neumococo que sintetizan diferentes niveles de MgaP, hemos demostrado que MgaP aumenta la transcripción del gen pclA in vivo, así como la actividad del promotor PpclA. Mediante footprinting con DNasa I y usando una versión de MgaP con cola de histidinas, hemos determinado que MgaP reconoce un sitio específico localizado upstream del promotor PpclA. Previamente, nuestro grupo estableció que el regulador MgaSpn activa al promotor P1623B uniéndose a un sitio específico localizado upstream de dicho promotor. Ahora, mediante análisis in silico, hemos encontrado que MgaP tiene la misma organización de dominios funcionales que MgaSpn. Además, el regulador MgaP, al igual que MgaSpn, interacciona con fragmentos de ADN lineal sin reconocer una secuencia nucleotídica específica y genera complejos multiméricos. A pesar de estas similitudes, MgaP y MgaSpn muestran diferente especificidad en su unión a ADN: MgaP no reconoce el sitio de unión de MgaSpn y viceversa.