Study of the role transmembrane domain of Type IV Coupling Proteins

Resumen

La conjugación bacteriana es el mecanismo más importante en la diseminación de genes de resistencia a antibióticos entre bacterias. Este proceso se realiza mediante unos complejos macromoleculares denominados Sistemas de Secreción de Tipo IV. Las proteínas acopladoras forman parte de estos sistemas, siendo una pieza clave en el proceso conjugativo.El objetivo de esta tesis doctoral ha sido caracterizar el funcionamiento de diferentes proteínas acopladoras, centrándose en el papel de su dominio transmembrana. Para ello se han seleccionado proteínas acopladoras de diferentes sistemas y características. Además se han creado proteínas mutantes (tanto quimeras como de delección) con las que estudiar la función del dominio transmembrana.En concreto se ha estudiado la actividad y la localización subcelular de las diferentes proteínas in vivo. Además se han desarrollado protocolos de purificación obteniendo muestras con las que realizar ensayos in vitro. De esta manera se ha caracterizado la estabilidad de las proteínas, su unión a moléculas de ADN, sus patrones de oligomerización, su estructura secundaria y su actividad ATP hidrolasa. Finalmente, se ha realizado la puesta a punto de técnicas de reconstitución en membranas modelo de las proteínasacopladoras, con el fin de realizar ensayos single-molecule en el futuro.En esta tesis se ha demostrado que las características descritas para la proteína acopladora TrwBR388, el paradigma de esta familia, no son extrapolables a todas las proteínas de la familia, remarcando así la necesidad de más estudios en este campo. // La conjugación bacteriana es el mecanismo más importante en la diseminación de genes de resistencia a antibióticos entre bacterias. Este proceso se realiza mediante unos complejos macromoleculares denominados Sistemas de Secreción de Tipo IV. Las proteínas acopladoras forman parte de estos sistemas, siendo una pieza clave en el proceso conjugativo.El objetivo de esta tesis doctoral ha sido caracterizar el funcionamiento de diferentes proteínas acopladoras, centrándose en el papel de su dominio transmembrana. Para ello se han seleccionado proteínas acopladoras de diferentes sistemas y características. Además se han creado proteínas mutantes (tanto quimeras como de delección) con las que estudiar la función del dominio transmembrana.En concreto se ha estudiado la actividad y la localización subcelular de las diferentes proteínas in vivo. Además se han desarrollado protocolos de purificación obteniendo muestras con las que realizar ensayos in vitro. De esta manera se ha caracterizado la estabilidad de las proteínas, su unión a moléculas de ADN, sus patrones de oligomerización, su estructura secundaria y su actividad ATP hidrolasa. Finalmente, se ha realizado la puesta a punto de técnicas de reconstitución en membranas modelo de las proteínasacopladoras, con el fin de realizar ensayos single-molecule en el futuro.En esta tesis se ha demostrado que las características descritas para la proteína acopladora TrwBR388, el paradigma de esta familia, no son extrapolables a todas las proteínas de la familia, remarcando así la necesidad de más estudios en este campo.