Trwbun motor molecular de unión específica a estructuras g-cuádruplex en el adn

Resumen

La transferencia de ADN por conjugación es un mecanismo de transferencia horizontal que permite la adquisición de nueva información genética de un modo rápido y natural. Este proceso implica un contacto físico entre las células donadora y receptora. Los sistemas conjugativos contienen una proteína clave en la membrana plasmática para llevar a cabo esta función: el transportador de ADN. En nuestro sistema modelo, el plásmido R388, este transportador es la proteína TrwB. La estructura cristalográfica de TrwB¿N70, la fracción soluble de TrwB, revela un hexámero formado por subunidades idénticas y simetría toroidal, con un canal interno de 20 Å de diámetro (Gomis-Ruth et al., 2001). Esta proteína presenta una gran similitud estructural con motores moleculares hexaméricos bien conocidos, tales como el complejo F1-ATPasa (Abrahams et al., 1994), FtsK (Massey et al., 2006) o helicasas en forma de anillo (Singleton et al., 2000), sugiriendo que TrwB también funciona como un motor, utilizando la energía liberada en la hidrólisis de ATP para bombear ADN de cadena sencilla a través de su canal central. En helicasas hexámericas que funcionan en dirección 5'- 3', el extremo 5' pasa a través del canal central de la proteína (Yu et al., 1996) mientras que el extremo 3' contacta la zona externa del hexámero (Ahnert and Patel, 1997). Así pues, de una manera similar, el T-DNA conjugativo sería transferido en dirección 5'-3' a través de la cavidad interna de TrwB. El mecanismo que proponemos para TrwB es similar al que presenta el complejo F1-ATPasa. La hidrólisis secuencial de ATP estaría acoplada a la translocación del ADN a través del poro central, siguiendo un mecanismo similar al "binding change mechanism" seguido por el complejo F1-ATPasa (Abrahams et al., 1994; Boyer, 1993). Sucesivos ciclos de hidrólisis de ATP permitirían cambios conformacionales alternantes en las seis subunidades. Proponemos por lo tanto un mecanismo común que podría aplicarse a una gran variedad de enzimas con un componente estructural común (Cabezon and de la Cruz, 2006). OBJETIVOS 1.Determinar la interacción de TrwB¿N70 con el relaxosoma mediante el estudio de interacciones proteína-proteína: Análisis del posible efecto de TrwA y TrwC sobre la actividad ATPasa de TrwB¿N70 y de los residuos implicados en la posible interacción TrwA-TrwB. 2.Análisis del complejo TrwA-TrwB. Determinación del estado oligomérico, purificación y análisis estructural por microscopía electrónica y cristalografía de rayos X. 3.Analizar diferentes substratos de ADN con TrwB¿N70. Comprobar cuál es el substrato preferente mediante ensayos de retardo en gel (EMSAs) y ensayos de actividad ATPasa. 4.Análisis de complejos TrwB/ADN. Determinación del estado oligomérico por cromatografía en gel-filtración. 5.Análisis estructural de complejos TrwB/ADN por microscopía electrónica y cristalografía de rayos X. Esta información nos permitiría obtener importantes datos en relación a la interacción proteína/ADN y el mecanismo de transporte. 6.Estudio del mecanismo de translocación de TrwB: Comprobar si el transporte va acompañado de una separación activa de las dos cadenas de ADN mediante una posible actividad helicasa. 7.Caracterizar las bases mecánicas y energéticas de funcionamiento del transportador de ADN mediante experimentos de pinzas ópticas. Esta aproximación nos permitiría comprobar de forma experimental aspectos importantes del mecanismo propuesto, tales como la velocidad de translocación sobre el ADN. 8.Estudio de la localización de TrwB in vivo, en células conjugando, mediante técnicas de microscopía de fluorescencia. Análisis mediante este tipo de técnicas, de la capacidad de TrwB de desplazar proteínas unidas al ADN en el proceso de translocación. Esta técnica se ha aplicado con éxito en este tipo de motores para demostrar su capacidad para translocar sobre ADN. RESULTADOS INTERACCIÓN DE TrwB¿N70 CON EL RELAXOSOMA Nuestro trabajo de investigación ha demostrado que la proteína TrwA estimula la actividad ATPasa de TrwB¿N70 a través de interacciones específicas entre ambas proteínas. TrwA promueve la oligomerización de TrwB, tal y como sugieren los ensayos de actividad ATPasa y el análisis por microscopía electrónica. El mayor efecto de TrwA es la estimulación de la actividad ATPasa de TrwB¿N70 en presencia de ADN. Este resultado sugiere que, en presencia de TrwA, TrwB¿N70 transloca sobre el ADN con alta procesividad. El dominio N-terminal de TrwA está implicado en la unión al ADN, mientras que el dominio C-terminal es responsable de la tetramerización de TrwA (Moncalian and de la Cruz, 2004). En este trabajo, hemos podido determinar que las interacciones entre TrwA y TrwB ocurren a través del dominio C-terminal de TrwA. La estequiometría 1:1 del complejo TrwA:TrwB obtenido por gel-filtración, ultracentrifugación analítica y por experimentos de cross-linking entre ambas proteínas, revela que la interacción entre ambas proteínas provoca la disociación de los tetrámeros de TrwA. La interacción ocurre entre los residuos 73-121 de TrwA. Sin embargo, no hemos podido determinar con más exactitud el modo de interacción de estos complejos con técnicas como la espectrometría de masas o cristalografía de rayos X de cristales TrwA-TrwB. El modo de interacción entre las proteínas TrwA/TrwB y la capacidad de TrwA para modular la actividad ATPasa de TrwB¿N70 son similares al mecanismo usado por otros motores moleculares que translocan ADN, tales como el sistema RuvA/RuvB, implicado en el proceso de recombinación homóloga. RuvA es una proteína tetramérica que se une al ADN (en una estructura Holliday junction), facilitando la carga de la proteína RuvB, un motor molecular hexamérico de la familia de RecA/AAA+ ATPasas a la que también pertenece TrwB. El dominio C-terminal de RuvA interacciona con RuvB y modula su actividad ATPasa. Además, a pesar de que el motor RuvA/RuvB trabaja como un complejo octámero/hexámero, eluye con estequiometría 1:1 en gel-filtración (Yamada et al., 2002). Así pues, el sistema RuvA/RuvB presenta una fuerte similitud mecanística con los resultados presentados aquí para el sistema TrwA/TrwB. Otro dato que apoya esta hipótesis, es el hecho de que TrwA forme octámeros en determinadas condiciones. INTERACCIÓN DE TrwB¿N70 CON EL ADN Experimentos llevados a cabo por Tato et al. (2005) pusieron de manifiesto que la actividad ATPasa de TrwB¿N70 era estimulada tanto por ADN de cadena sencilla como de cadena doble. Aunque la tasa de actividad en presencia de ADN es elevada en experimentos realizados in vitro, el papel de TrwB sobre ADN de cadena doble in vivo no es del todo claro, puesto que está demostrado que el substrato que se transloca en el proceso de la conjugación es ADN de cadena sencilla (Cohen et al., 1968; Ohki and Tomizawa, 1968). Por este motivo, decidimos llevar a cabo un extenso análisis con varios substratos de ADN, con el fin de esclarecer el tipo de substrato de ADN preferente para TrwB. Encontramos una correlación entre la capacidad de un oligonucleótido para formar estructuras secundarias y la estimulación de la actividad ATPasa de TrwB¿N70. Sorprendentemente, los oligonucleótidos que estimulaban la actividad ATPasa de TrwB en mayor medida, presentaban una secuencia rica en guaninas, que permitía la formación de estructuras secundarias del tipo G-quádruplex. Los resultados obtenidos demuestran que TrwB es una proteína de unión específica a ADN con estructura y que substratos G-quádruplex podrían ser la diana natural para la actividad de TrwB in vivo. TrwB¿N70 se une a G4-ADN con una afinidad 100 veces mayor que sobre ADN de cadena sencilla con la misma secuencia y es al menos 25 veces más eficaz en hidrolizar ATP en presencia de un oligonucleótido con estructura G-quádruplex. Además, la proteína sólo hexameriza en presencia de estructuras G-quádruplex, tal y como hemos demostrado en experimentos de centrifugación analítica y cromatografía en gel-filtración. Motivos estructurales de tipo G-quádruplex están presentes en todos los genomas y, como en el caso de los telómeros, desempeñan un papel esencial en cáncer y envejecimiento. También están presentes en promotores de muchos genes humanos, regulando la transcripción y replicación de ADN. En estos casos, existen helicasas específicas (tipo RecQ) que actúan resolviendo este tipo de estructuras, permitiendo que dichos procesos se lleven a cabo de forma correcta (Karow et al., 2000). Así pues, nuestros resultados sugerían que TrwB podría estar involucrada en resolver estructuras secundarias del tipo G-quadruplex, formadas durante el procesamiento del ADN conjugativo, permitiendo que el ADN de cadena sencilla sea transportado a través de su canal central. Sin embargo, a pesar de que una amplia variedad de substratos de ADN han sido ensayados, incluyendo estructuras G-quádruplex intermoleculares, no hemos podido observar una actividad helicasa en TrwB¿N70 hasta el momento. En base a lo anteriormente expuesto, nuestros resultados parecen indicar que TrwB utiliza una estructura G-quádruplex para ensamblarse sobre el ADN. FtsK, una proteína de la misma familia que TrwB implicada en translocar ADN cromosómico en el proceso de división bacteriana, reconoce una secuencia denominada KOPS (FtsK orientating polarized sequence) en el ADN, la cual actúa como sitio de carga orientando FtsK correctamente sobre el ADN para su posterior translocación (Bigot et al., 2005). Curiosamente, KOPS es una secuencia rica en guaninas (5'-GGGNAGGG-3') susceptible de formar estructuras secundarias de tipo G-quádruplex, como en nuestro caso. ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA Mediante microscopía electrónica, se visualizaron complejos oligoméricos de TrwB¿N70 cuando la proteína era incubada previamente con TrwA. Estos resultados corroboran la hipótesis de que TrwA promueve la oligomerización de TrwB. Por otra parte, la microscopía electrónica también reveló la presencia de complejos oligoméricos de TrwB¿N70 cuando la proteína era incubada con un ADN que forma una estructura G-quádruplex. Previamente, se demostró cómo este ADN con estructura promovía la hexamerización de TrwB¿N70 y estimulaba su actividad ATPasa. Se obtuvieron cristales de complejos TrwA-TrwB¿N70 que fueron analizados por difracción de rayos X. A pesar de que estudios preliminares parecían indicar que ambas proteínas estaban presentes en los cristales, tras difractarlos en el ESRF (Grenoble, Francia) y procesar los datos, no pudimos observar una densidad electrónica extra que correspondiese a TrwA. TrwB sólo forma hexámeros en presencia de ADN con estructura G-quádruplex. Este hecho fue corroborado por experimentos de ultracentrifugación analítica, en los que el resultado obtenido al incubar TrwB con un ADN sin estructura es compatible con un complejo 1:1, correspondiente con un estado monomérico de TrwB. Por el contrario, si se incuba TrwB con un substrato G-quádruplex, los valores obtenidos son compatibles con complejos 6:1 o 4:1, correspondiente con estados oligoméricos de TrwB mayores (68.5% y 26.6%, respectivamente). Experimentos de cromatografía en gel-filtración mostraron el mismo resultado. Cuando TrwB se incubada con un ADN sin estructura, la muestra eluía con una masa molecular estimada de ~100 kDa, correspondiente a un complejo formado por un monómero de proteína con una molécula de ADN. Sin embargo, cuando TrwB era incubada con un ADN del tipo G-quádruplex, la muestra eluía con una masa estimada de ~440 kDa, correspondiente a un complejo hexamérico de TrwB con el ADN. Se obtuvieron cristales de complejos TrwB¿N70/G4-ADN. Cuando los cristales fueron analizados por difracción de rayos X, se apreció que la nueva estructura era distinta a la obtenida para la proteína nativa. El análisis de los mapas de densidad electrónica puso de manifiesto cambios interesantes, como el diámetro de la molécula en la nueva estructura, ahora más extendida comparada con la estructura nativa. Además, existía una clara asimetría en las distintas subunidades, con desviaciones de más de 4 Å, principalmente asociadas al dominio de unión a nucleótidos. Estos datos sugieren que la unión del ADN induce un cambio conformacional en la proteína, promoviendo una asimetría en la molécula. A pesar de que hasta el momento no hemos podido observar una densidad electrónica extra que pueda ser interpretada como ADN, no podemos descartar la posibilidad de que exista una ocupación parcial por el ADN o bien que éste se una a subunidades distintas en las diferentes moléculas del cristal. A pesar de que estos resultados pueden no ser concluyentes, concuerdan con nuestra hipótesis inicial sobre el mecanismo de TrwB. La estructura nativa resuelta presenta un eje de simetría seis; las seis subunidades son idénticas. Probablemente representa la proteína en un estado inactivo. La unión del ADN al canal central podría promover una conformación asimétrica y una hidrólisis secuencial de ATP, siguiendo un mecanismo similar al denominado "binding change mechanism" descrito para el complejo F1-ATPasa (Cabezon and de la Cruz, 2006). Es tentador proponer que la asimetría causada por la subunidad-¿ en la F1-ATPasa podría también ser producida en TrwB tras la unión del ADN. ANÁLISIS DEL PROCESO DE TRANSLOCACIÓN SOBRE EL ADN CON PARTÍCULAS INDIVIDUALES: PINZAS ÓPTICAS Mediante la utilización de las pinzas ópticas, nos propusimos estudiar el mecanismo molecular que permite la conversión de energía en un trabajo mecánico; en este caso, de transporte de ADN a través del canal central. Esta parte del trabajo se ha llevado a cabo en colaboración con los Dres. Borja Ibarra, Jose María Valpuesta y José López-Carrascosa, en el CNB, Madrid. En nuestros experimentos con TrwB¿N70, partimos de dos tipos de microesferas, cuya superficie marcamos con anticuerpos anti-Histidina para unirse a TrwB¿N70 y con anti-Digoxigenina para unirse al ADN. En Santander, clonamos TrwB¿N70 con una cola de Histidinas en el extremo N-terminal y preparamos distintos tipos de substratos de ADN marcados con Digoxigenina en su extremo 5'. En este experimento, los dos tipos de substratos, proteína unida a esferas marcadas con anticuerpos anti-His y ADN unido a esferas marcadas con anti-Dig, entran en contacto a través de la interacción de TrwB¿N70 con el ADN. En presencia de ATP, es de esperar que TrwB ejerza un movimiento de translocación sobre el ADN, que podremos cuantificar en función del desplazamiento de una esfera en relación a la otra. La medición de esta distancia en función del tiempo nos permitiría obtener información sobre la velocidad de translocación del motor. La técnica permite además medir la procesividad del motor, el trabajo ejercido, el tipo de substrato que proporciona mayor actividad, etc. Hasta el momento, no hemos tenido éxito en este tipo de experimentos. Uno de los principales problemas es la débil unión de TrwB¿N70 a las microesferas a través de la incorporación de una cola de Histidinas. Por este motivo, futuros experimentos se centrarán en la biotinilación de TrwB¿N70 en el extremo N-terminal. MARCAJE FLUORESCENTE Y LOCALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS TrwB y TrwC EN EXPERIMENTOS in vivo En un intento de extrapolar los resultados anteriormente expuestos al mecanismo de TrwB in vivo, decidimos aplicar técnicas de microscopía de fluorescencia. Este tipo de técnicas han sido aplicadas con éxito al estudio de otros motores moleculares, como SpoIIIE, en el laboratorio del Dr. Rudner, Harvard Medical School (Massachussetts-Boston). TrwB presenta similitud structural con la familia FtsK/SpoIIIE de transportadores de ADN dependientes de ATP. Los experimentos llevados a cabo por Rudner y colaboradores, mediante este tipo de técnicas, han demostrado que los dos brazos del cromosoma bacteriano son bombeados simultáneamente a la preespora. SpoIIIE, como TrwB, tiene un segmento transmembrana N-terminal necesario para su correcta localización en la membrana, de forma que SpoIIIE-GFP se acumula en el septo en foci puntuales cuando el ADN es transportado a la preespora. Además, la formación de estos foci requiere la presencia de ADN en el septo y la proteína permanece allí hasta que el cromosoma ha sido bombeado a la preespora en su totalidad (Burton et al., 2007). En nuestro sistema modelo (el plásmido R388), la proteína TrwC corta el ADN del plásmido en el origen de transferencia (oriT) y permanece unida covalentemente al extremo 5'. TrwC unida al ADN de cadena sencilla del plásmido es transferida inicialmente a la célula recipiente a través del sistema de un sistema de secreción tipo IV (T4SS). Según nuestro modelo, es entonces cuando TrwB se ensambla como hexámero alrededor del ADN de cadena sencilla y, utilizando la energía liberada de la hidrólisis de ATP, bombea el ADN restante (Cabezon and de la Cruz, 2006). Curiosamente, durante la esporulación, el 30% del cromosoma de la preespora está posicionado ya dentro del compartimento de la propia preespora y se requiere la actividad ATPasa de SpoIIIE para activar la translocación del restante 70% de cromosoma al interior de la preespora (Wu and Errington, 1998). Es muy probable que ambas proteínas, SpoIIIE y TrwB, se ensamblen sobre el ADN de una forma similar. Burton y cols. (2007) desarrollaron un ensayo fluorescente para monitorizar la transferencia de ADN (Michaelis et al., 1997). Los datos obtenidos apoyan un modelo para el transporte de ADN, en el cual el segmento transmembrana de SpoIIIE forma un canal que atraviesa las dos bicapas lipídicas. En un intento de reproducir estos experimentos con TrwB, decidimos iniciar una colaboración con el Dr. Rudner, a través de una estancia corta en su laboratorio. Nuestro objetivo inicial fue estudiar la localización de TrwB in vivo, usando microscopía de fluorescencia; así como analizar la capacidad de este motor para desplazar proteínas previamente unidas al ADN. Para ello, construímos clones de TrwB y TrwC fusionados a GFP (green fluorescent protein), mGFP (monomeric green fluorescent protein) o mChFP (monomeric cherry fluorescent protein) y monitorizamos TrwB-GFP y TrwC-GFP en células durante el proceso conjugativo. Los datos preliminares obtenidos en estos experimentos parecen indicar que TrwB presenta una localización homogénea en la membrana en células fijadas; mientras que en células conjugando, en contacto directo con células recipientes, la proteína muestra una localización polar en foci. Estos datos concuerdan con los obtenidos para SpoIIIE, en los que observa una localización de la proteína en foci puntuales únicamente cuando el ADN está presente, manteniendo a la proteína en el septo hasta que el transporte de ADN ha concluído. En futuros experimentos, pretendemos tomar imágenes a tiempo real de células conjugando, con el fin de observar directamente cómo cambia la localización de TrwB cuando una célula donadora contacta con una célula receptora. Éstos y otros experimentos con las construcciones fluorescentes de TrwC, nos permitirán estudiar diferentes aspectos del mecanismo de transporte in vivo y diferenciar aspectos esenciales implicados en el transporte de ADN y/o proteína.