Generation of new LGMDR1 models with CRISPR/Cas9 and studies to expand insight into the disease

Resumen

La LGMDR1 es la forma más común de las distrofias musculares de cinturas, y está causada por mutaciones enel gen CAPN3. Este gen codifica la proteína calpaína 3, una proteasa no lisosomal que se expresa principalmenteen el músculo esquelético. La enfermedad, que actualmente no tiene cura ni tratamiento disponible, se caracterizaclínicamente por una debilidad muscular progresiva que afecta tanto a las cinturas pélvica y escapular como alos músculos proximales de las extremidades. Actualmente, la investigación en LGMDR1 requiere por un ladode mejores modelos animales y celulares para su investigación, ya que los existentes presentan limitaciones porla ausencia de un proceso distrófico claro, y por otro lado de una mayor comprensión del impacto de la ausenciade calpaína 3 en el músculo. Con esto en mente, en esta tesis se fijaron como objetivos principales 1) Desarrollarun modelo in vitro basado en líneas isogénicas de iPSCs KO para calpaína 3 mediante el uso de CRISPR/Cas9.2) Evaluar las consecuencias de la ausencia de calpaína 3 en procesos musculares mediante el uso del modelogenerado y el modelo en ratón existente (C3KO). 3) Generar un nuevo modelo in vivo KO de calpaína 3 en laespecie porcina mediante el uso de CRISPR/Cas9. Tras el trabajo realizado, se obtuvo el modelo in vitro que seplanteó y se caracterizó, el cual diferenciaba adecuadamente a células musculares. Los estudios con el modelogenerado y el ratón C3KO concluyeron que la miogénesis está afectada en ausencia de calpaína 3, se estudió larespuesta al daño muscular agudo y se identificaron proteínas y funciones desreguladas. En cuanto al modeloporcino, tras optimizar el protocolo para la obtención de embriones KO de calpaína 3, se realizaron variastransferencias embrionarias, pero ninguna de las gestaciones dieron como resultado un lechón KO por lo que nose llegó a conseguir el modelo.