Nanotomografía de rayos x en el borde de absorción (neasxt) para la detección y metálicas intracelulares

Resumen

Partiendo de la experiencia acumulada por el grupo en el desarrollo pionero de la técnica correlativa entre microscopía de epifluorescencia y crio-tomografía de rayos X de baja energía, hemos desarrollado, siguiendo una aproximación tomográfica y correlativa, la nanotomografía de rayos X de baja energía en el borde de absorción (NEASXT), que es capaz de resolver la estructura celular 3D simultáneamente a la detección inequívoca y cuantificación de partículas superparamagnéticas (SPION) intracelulares (técnica de cuantificación in situ). Comparada con otras técnicas in situ, este método presenta elevada resolución (50 nm) en el rango de célula completa y con un límite de detección de 0,37 ± 0,18 g/cm3. Además, no se produce daño por radiación a la resolución dada y se emplea un tiempo de adquisición que permite la obtención de suficiente número de muestra para afrontar la variabilidad existente en las muestras biológicas. El desarrollo de esta nueva técnica empleando rayos X de baja energía se implementó en el microscopio MISTRAL y requirió el desarrollo de nuevas aproximaciones para la adquisición de datos, como el desarrollo de archivos de comandos de control del microscopio, y del procesamiento de los mismos, como la aplicación de la deconvolución de las imágenes de proyección empleando la función de transferencia de modulación del microscopio. Dado que la absorción de rayos X es proporcional a los elementos que forman parte de la muestra y a la concentración de éstos, podemos extraer información cuantitativa de los volúmenes reconstruidos. Teniendo ésto en consideración, estudiamos empleando la técnica NEASXT la acumulación intracelular de SPION en células de adenocarcinoma humano tratadas durante distintos tiempos con éstas. La resolución de la estructura celular 3D empleando la técnica NEASXT permitió la localización de las nanopartículas intracelulares, por lo que encontramos que las SPION se acumulan en el citoplasma, no detectándose su presencia en el núcleo celular. Como dato cuantitativo encontramos que la cantidad de SPION intracelulares incrementa conforme lo hace el tiempo de incubación. Además, pudimos extraer el tamaño y volumen de los acúmulos intracelulares de SPION encontrando que estos parámetros también se incrementan con el tiempo de incubación.