Engineering repeat proteins as building blocks for functional nanostructures and materials

Resumen

La generación de nano-dispositivos y materiales funcionales para aplicaciones en nanotecnología y biomedicina requiere el control preciso de elementos funcionales en diferentes escalas de tamaño. Para definir las propiedades finales de los materiales y nano-dispositivos es necesario controlar la disposición de los elementos a diferentes escalas de tamaños: nanométrica, micromética y macrométrica. Sin embargo, la tecnología actual carece de la precisión necesaria para obtener ese control y, normalmente, la generación de dispositivos con propiedades definidas se hace mediante “prueba y error”. El mayor obstáculo para el desarrollo de estas tecnologías de precisión es el poco conocimiento a nivel atómico que se tiene de los materiales que se utilizan. Para intentar solucionar este problema, últimamente se está investigando en la generación de materiales mediante el proceso de auto-ensamblaje. El proceso de auto-ensamblaje se basa en interacciones específicas entre elementos pequeños y simples para formar estructuras supramoleculares complejas. La simplicidad de sus elementos hace más sencillo conocer y controlar el sistema. En esta tesis, se utiliza el proceso de auto-ensamblaje para crear estructuras funcionales basadas en proteínas en las que los elementos están ordenados en diferentes escalas de tamaños. Las proteínas son moléculas muy versátiles y robustas que tienen un gran potencial en la generación de estructuras y materiales. Sin embargo, las interacciones entre proteínas no son fáciles de controlar debido a la gran cantidad de interacciones que hay que tener en cuenta para definir sus estructuras. No obstante, las proteínas de repetición ofrecen una nueva visión en el diseño de proteínas para la generación de estructuras ordenadas funcionales debido a su simplicidad. Las proteínas de repetición están compuestas por un número variable de unidades básicas que se repiten a lo largo de la proteína y su plegamiento está dominado por interacciones regulares de corto alcance (Figura R1). Estas características hacen que el sistema sea más sencillo de entender y de controlar. Figure R1. Representación de diferentes proteínas de repetición. Para cada familia de repetición se muestra, en la primera fila de la tabla, la estructura y la representación esquemática de cada unidad básica que componen las diferentes proteínas de repetición: en azul el módulo “ANKyrin repeat” (ANK), en naranja el módulo “TetratricoPeptide Repeat” con la secuencia consenso (CTPR) y en verde el módulo “Leucin Rich Repeat” (LRR). En la segunda fila de la tabla, la estructura cristalina de las proteínas de repetición compuestas por 4 repeticiones de cada unidad básica, utilizando el mismo código de colores que en la fila de arriba. Estas estructuras muestran diferentes empaquetamientos que dependen de la unidad básica de repetición que las componen. Las estructuras se acompañan de esquemas que representan el empaquetamiento en dirección N-terminal C-terminal de las diferentes estructuras cristalinas. Concretamente, en esta tesis se utilizan las CTPR, basadas en la secuencia consenso del módulo “TetratricoPeptide Repeat”, para la generación de estructuras funcionales. La estructura y la estabilidad de las CTPR están muy bien caracterizadas. Las CTPR tienen únicamente unos pocos aminoácidos conservados que definen su plegamiento característico. Los demás aminoácidos admiten variaciones sin perturbar la estructura de estas proteínas. Esta característica de las CTPRs aporta flexibilidad a la hora de introducir nuevas reactividades a lo largo de la proteína para generar proteínas modificadas para diversas aplicaciones. Esta tesis consta de dos capítulos principales. En el capítulo 1, “Diseño de proteínas CTPR para la generación de estructuras auto-ensambladas”, se explica el diseño, generación y caracterización de diferentes estructuras supramoleculares modificando, de forma controlada, el proceso de auto-ensamblaje de las CTPRs. En el capítulo 2, “Estructuras funcionales bio-híbridas basadas en las CTPRs”, se explica la generación de estructuras funcionales usando como molde las proteínas CTPR. Para ello, se introducen diferentes reactividades a lo largo de la proteína con resolución atómica donde se van a conjugar diferentes elementos activos. Una vez tenemos formados los conjugados entre la proteína y los elementos activos, se generan las estructuras funcionales mediante el auto-ensamblaje de dichos conjugados. Capítulo 1. Diseño de proteínas CTPR para la generación de estructuras auto-ensambladas. En este capítulo, se explica la generación y caracterización de estructuras ordenadas formadas a partir del auto-ensamblaje de proteínas CTPR. En concreto, se generan estructuras de diferentes dimensionalidades: nanofibras de proteína, monocapas 2D compactas y nanotubos de proteínas 3D (Figura R2). Figura R2. Diferentes tipos de estructuras auto-ensambladas formadas a partir de la modificación de las interacciones entre las proteínas CTPR. A la izquierda, se representa la proteína CTPR señalando la modificación que da lugar a la interacción entre proteínas para la generación de la estructura auto-ensamblada. A al derecha, se representa la estructura obtenido debido a esa interacción entre las proteínas. De arriba hacia abajo: fibras, monocapas compactas y nanotubos de proteína. Las proteínas CTPR son modificadas para codificar interacciones específicas entre ellas para la generación de las diferentes estructuras. En el capítulo se diseñan y se sintetizan los diferentes variantes de proteína que dan lugar a las diferentes estructuras. Además, se caracteriza, en detalle, el proceso de auto-ensamblaje de los diferentes variantes y las propiedades biofísicas de las estructuras obtenidas. Capítulo 2. Estructuras funcionales bio-híbridas basadas en las CTPRs En este capítulo, se generan estructuras funcionales bio-híbridas usando como molde las proteínas CTPR. Se explota el conocimiento a nivel atómico de la estructura de las CTPR para introducir reactividades a los largo de la proteína (Figura R3) para usarla como molde para ordenar elementos activos a escala nanométrica. Los elementos activos que se ordenan son: partículas de oro, moléculas dadoras-aceptoras, nanotubos de carbono, y clústeres metálicos (Figura R3.B). Una vez se obtiene el control en el proceso de conjugación, se combina con el control adquirido en el capítulo 1 de generar las estructuras auto-ensambladas para generar estructuras bio-híbridas donde los elementos activos están ordenados a diferentes escalas de tamaños: escala nanométrica, micrométrica y macrométrica. Como ejemplo, se generan monocapas de partículas de oro, films ordenados de partículas de oro y films ordenadas de moléculas dadoras-aceptoras. Además, se genera un sistema multifuncional imitando los fotosistemas naturales (Figura R3.C). Las estructuras funcionales generadas tienen propiedades que dependen de la disposición de los elementos activos en el sistema.