Caracterización de las propiedades mecánicas de bacteriófagos mediante microscopía de fuerzas atómicas

Resumen

Resumen: Los virus pueden ser considerados como los organismos más abundantes en la naturaleza. Se ha estimado que existen alrededor de 1031 partículas virales, superando el número de bacterias en un orden de magnitud (1). Los virus, durante su ciclo, están expuestos a diversos ataques físico-químicos. Para adaptarse a estas condiciones, han evolucionado modificando su estructura para alcanzar una mayor estabilidad. Estas modificaciones conllevan desde cambios conformacionales en las proteínas que componen la cápsida, como pueden ser giros y cambios de orientación, hasta variaciones en la forma y el tamaño. Estas reestructuraciones, que dependen de la ruta de maduración desarrollada por el virus, se manifiestan tanto en las propiedades físicas como en las químicas(2, 3) (4-8). Por tanto, los mecanismos desarrollados por estas nanomáquinas para adaptarse ante condiciones fisicoquímicas extremas y completar su ciclo viral, son complejos a la vez que fascinantes. La investigación de las propiedades físico-químicas de estructuras víricas es importante, no sólo para fundamentar sus funciones biológicas, sino también para determinar sus capacidades como contenedores artificiales en medios agresivos (9-11). En particular, las propiedades mecánicas de estos agregados proteicos dependen fuertemente no sólo de su estructura, sino también de su función a lo largo del ciclo biológico. De forma específica, la estabilidad de las cápsidas víricas se modula durante el proceso de maduración, que convierte estos contenedores proteicos inertes en viriones, es decir, partículas con capacidad infectiva (2, 12-14) . Por ello, esta tesis se ha centrado en la caracterización mecánica de bacteriófagos que presentan diferentes mecanismos de maduración, desde cambios conformacionales que reestructuran las proteínas de la cápsida del virus, hasta la unión específica al exterior de la estructura vírica de proteínas extras. La comparación de las propiedades mecánicas medidas en esta tesis ha permitido resolver la eficiencia de los diferentes procesos a la hora de estabilizar el virus frente a ataques fisicoquímicos externos. Además, se han encontrado relaciones precisas entre sus propiedades mecánicas y el mecanismo de translocación de material genético durante el proceso de infección. Por tanto se ha relacionado propiedades con la estabilidad mecánica de la cápsidas víricas así como con funciones biológicas determinadas (14-17). Se ha utilizado técnicas de nanoindentación de microscopía de fuerzas (AFM) en partículas víricas adsorbidas en superficies en condiciones fisiológicas (12, 18). El microscopio de fuerzas atómicas se considera como una herramienta complementaria a las técnicas de volumen, ya que no puede competir en resolución con la criomicroscopía electrónica (cryo-EM), del orden de unos pocos angstroms. En cambio el AFM proporciona información acerca de propiedades físicas como dureza, fragilidad, estabilidad, constante dieléctrica, carga superficial, etc, que no pueden ser observadas y medidas con técnicas como TEM, cryo-EM, rayos X, calorimetría, etc. Además la ventaja que presenta el AFM, es que se puede obtener información a nivel de partícula individual. Trabajar con estos fagos nos permitirá comparar los diferentes mecanismos de estabilización de la cápsida utilizados por los virus y evaluar la eficiencia de los mismos. La tesis está dividida en tres partes. La primera parte correspondiente se introduce la nanociencia, marco en el cual se sitúa esta tesis dada la escala manométrica de los sistemas estudiados. Debido al carácter multidisciplinar de los experimentos y a la naturaleza biológica de los sistemas de estudio se han dedicado unas páginas a introducir la biofísica. Además, se han descrito de manera detallada tanto los sistemas biológicos estudiados (virus) como la herramienta principal utilizada (el Microscopio de Fuerzas Atómicas), junto con sus aplicaciones para los estudios de sistemas biológicos. La segunda parte hace referencia a la caracterización de las propiedades mecánicas de tres sistemas bacteriófagos: ¿29, T7 y ¿ (5, 19-21). El objetivo principal de esta parte es el estudio de los cambios en las propiedades mecánicas que se producen en las estructuras de las partículas víricas durante el ciclo biológico de estos fagos. Mediante microscopía de fuerzas atómicas se ha obtenido información acerca de la morfología, presión interna y propiedades mecánicas de sus cubiertas proteicas. En cuanto a las propiedades mecánicas, se ha prestado especial atención a la respuesta elástica, la fragilidad y la estabilidad. Los tres bacteriófagos estudiados, ¿29, T7 y ¿, se caracterizan por seguir una ruta de maduración muy similar: formación de la precabeza, expansión, estabilización y empaquetamiento del material genético. La diferencia que existe entre ellos es el mecanismo utilizado para estabilizar la cápsida (4, 5, 20, 22). En la tercera parte de esta tesis se presenta la teoría de multi-armónico 0+1+2 como una nueva herramienta para obtener información acerca de las propiedades físicas de los materiales usando el modo dinámico AM-DAFM (Amplitude Modulation Dynamic Atomic Force Microscopy o Modo Dinámico de Modulación en Amplitud). Usando esta teoría se han estudiado las propiedades físicas del bacteriófago ¿29 (23). Los resultados de elasticidad extraídos de los experimentos han sido comparados con las predicciones que se obtienen de simulaciones basadas en el método de elementos finitos (Finite Element Methods; FEM) y basadas en el modelo de grano grueso (Coarse-Grained Model; CGM) así como con los resultados que predice la teoría de la elasticidad de medios continuos (15-17, 24-26). Este tipo de simulaciones han permitido dar una interpretación sobre los resultados experimentales obtenidos y estimar nuevas propiedades físicas anteriormente no descrita usando la microscopía de fuerzas atómicas.