Caracterització de lestructura i funció del transportador de melibiosa dEscherichia coli per espectroscòpia dinfraroig

Resumen

La MelB és una proteïna integral de membrana dEscherichia coli (473 amino àcids) que transporta ?- o ?-galactòsids a linterior de la cèllula, gràcies a lenergia obtinguda dels cations Na+, H+ o Li+ que cotransporta de forma simport. Cada catió competeix pel mateix lloc dunió, essent el Na+ i el Li+ millors activadors. El model topològic destructura secundària acceptat actualment consta de 12 hèlixs transmembrana, amb el costat N- i C-terminal a la cara citoplasmàtica de la membrana. En aquest treball, sha estudiat la proteïna solubilitzada i reconstituïda en lípids dE.coli en quatre condicions diferents de substrats: Na+, H+, Na+ i melibiosa i H+ i melibiosa. Primerament, es va estudiar i quantificar lestructura secundària de la MelB per espectroscòpia dinfraroig de transmissió. Lestudi revelà lexistència de dos tipus dhèlixs alfa que sofreixen canvis conformacionals deguts a la unió a diferents substrats, essent la unió del catió Na+ el que produeix canvis majors. Aquest resultat, és coherent els canvis conformacionals a nivell dels triptòfans intrínsecs de la proteïna trobats per espectroscòpia de fluorescència. La solubilització de la MelB en detergents desnaturalitzants o bé, lescalfament daquesta en detergent dodecil maltòsid, estats en que la proteïna no és funcional, provoca que els dos tipus dhèlixs alfa es converteixen en un de sol. Això indicaria que lexistència daquests dos tipus dhèlixs alfa són molt importants pel funcionament de la proteïna. La quantificació de lestructura secundària donà un 50% dhèlixs, 20% de làmina beta, 17% de girs reversos i un 11% assignat a hèlixs 310, llaços oberts o bé hèlixs alfa. Assignació que concorda amb el model topològic de 12 hèlixs transmembrana. La quantificació obtinguda en D2O va reforçar aquests resultats. En segon lloc, es va aplicar la tècnica del bescanvi H/D per ATR-FTIR a la MelB, particularment útil per a estudiar les propietats dinàmiques de les proteïnes de membrana que són en general, àmpliament desconegudes. Els resultats ens mostren que la MelB és una proteïna relativament accessible, amb un bescanvi H/D a les 24h del 60%. La comparació dels nivells de bescanvi de la MelB en diferents condicions de substrats ens suggereix que laddició de melibiosa redueix significativament laccessibilitat al solvent aquós. Un anàlisi més profund del bescanvi H/D a nivell destructura secundària, revelà diferències en diferents condicions de substrats. En particular, a nivell destructura làmina beta i en menys grau a nivell destructura hèlix alfa. La unió de melibiosa confereix més protecció a ambdós tipus destructura. Aquesta tècnica també es va aplicar al mutant de la MelB, el R141C, en les mateixes condicions de substrats. El R141C és capaç dunir els substrats de la MelB però no els transloca a laltra cara de la membrana. Els resultats indiquen que el mutant unit al H+ és un 10% més accessible al solvent aquós que la MelB salvatge en la mateixa condició. Laddició de substrats també comporta canvis conformacionals, en aquest cas a nivell destructura làmina beta, alfa hèlix i girs reversos. Laddició de melibiosa també protegeix lestructura làmina beta envers el bescanvi H/D, encara que en la condició Na+/melibiosa és la més protegida. Finalment, es va aplicar la tècnica de polarització per ATR-FTIR per estudiar si la unió de diferents substrats també resultava en canvis dorientació de les hèlixs transmembrana. Mitjançant els espectres de polarització parallel i perpendicular es calcula el paràmetre dordre, necessari pel càlcul de langle dorientació. Els resultats demostren que la proteïna reconstituïda en liposomes està orientada. Les dues bandes principals corresponen a segments transmembrana helicoïdals. La MelB sense substrats (H+/MelB) mostra un angle de 26º respecte la normal a la bicapa i no sofreix cap canvi en afegir melibiosa. Tot al contrari, quan afegim Na+ a la MelB langle dorientació és de 36º i la posterior addició de melibiosa el disminueix de lordre de 5º. ________________________________________________ MelB is an integral membrane of Escherichia coli (473 amino acids) that couples uphill transport of alpha- or beta-galactosides to the downhill inward movement of Na+, Li+, or H+. The coupling ions compete for the same binding site and enhanced the affinity of the co-transported sugar, with Na+ and Li+ as better activators than H+. The secondary structure topological model consist in 12 transmembrane segments with the N and C termini located in the cytoplasm. In this work, solubilized and reconstituted MelB in four different substrate conditions have been studied: Na+, H+, Na+ with melibiose and H+ with melibiose. Firstly, MelB secondary structure analysis and quantification were performed by transmission infrared spectroscopy. Results revealed the existence of two type of alpha-helices which suffer conformational changes by different substrate binding, being Na+ the one who produces major changes. This result is coherent with the intrinsic triptophan conformational changes studied by fluorescence spectroscopy. MelB solubilized in denaturating detergents or warmed up in dodecil maltosid, states where the protein is not functional, outcome one only alpha helical band instead of two. This would indicate that the two alpha helical existence is very important for the normal protein function. The secondary structure quantification gave a 50% of alpha helices, 20% beta sheet, 17% reverse turns and 11% assigned to 310 helices, open loops or alpha helices. This assignation agrees with the 12 transmembrane helices topological model. The obtained D2O quantification reinforces these results. Secondly, the H/D exchange technique by ATR-FTIR was applied, particularly useful to study membrane proteins dynamics properties widely unknown. Results shown that MelB is a relatively accessible protein, with and H/D exchange of 60% after 24 hours. The MelB H/D exchange in different substrate conditions comparison, suggested that melibiose addition significantly reduces its aqueous solvent accessibility. A deeper H/D exchange analysis at a secondary structure level, revealed conformational changes in different substrate conditions. Particularly, at the beta sheet and in less amount at the alpha helical level. Melibiose binding gives more protection to both types of structures. This technique was also applied to the MelB mutant, the R141C, in the same substrate conditions. The R141C mutant is capable of binding substrate but not of trasnlocating them on the other membrane site. The results indicate the mutant bind to H+ is about 10% more accessible to the aqueous solvent than the wild type MelB in the same condition. Substrates addition also produces conformational changes, in this case at the beta sheet, alpha helical and reverse turns level. Incubation with melibiose protects beta sheet against the aqueous solvent, too, although the Na/melibiose conditions is the most protected state. Finally, the polarization technique by ATR-FTIR was applied to study if the different substrate binding also resulted into orientation changes of the transmembrane helices. By means of parallel and perpendicular polarized spectra the order parameter can be calculated, a necessary tool to calculate the orientation angle of the protein structures. The results demonstrate that the reconstituted protein is oriented. The two main bands principally correspond to helicoidal transmembrane segments. MelB without asubstrates (H+/MelB) shows an orientation angle of 26º and doesnt suffer any significant change by melibiose addition. On the contrary, when Na+ is bind to MelB the orientation angle is of 36º and the posterior melibiose addition reduces it about 5º.