Los canales kv7 en musculatura esquelética. Asociación oligomérica a subunidades reguladoras kcne

Resumen

Los canales de potasio son proteínas con una gran importancia fisiológica debido a su participación en procesos tan importantes para el organismo como pueden ser la transmisión del potencial de acción cardíaco o neuronal. En musculatura esquelética poseen también sus funciones, aunque falta mucho por conocer. En este trabajo estudiamos el posible papel de dos isoformas de canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) de la familia Kv7, la 1 y la 5 en fenómenos de proliferación mioblástica y diferenciación miotubular. Para realizar nuestros estudios utilizaremos una línea celular derivada de músculo esquelético de rata, L6E9. Nuestros resultados nos indicaron que mientras que Kv7.1 incrementaba su expresión génica (pero no protéica) durante la proliferación de L6E9, no poseía una función principal en el desarrollo de este proceso. A su vez, Kv7.5 incrementaba sus niveles génicos y protéicos a lo largo de la proliferación y mediante estudios farmacológicos observamos que parecería tener un papel en la progesión del ciclo celular de los mioblastos, controlando el paso de fases G1/S. Contrariamente al proceso de proliferación, no observamos ningún cambio de expresión de estos canales a lo largo de ladiferenciación miotubular. Los canales de potasio no están constituídos sólo por una subunidad conductora que forma el poro del canal, si no que unida a esta subunidad existen una gran diversidad de proteínas auxiliares que pueden estar modificando la actividad del canal. En el caso concreto de la familia Kv7 son de gran importancia unas proteínas auxiliares denominadas KCNE. Existen 5 isoformas de esta familia y mediante estudios de RT-PCR, detectamos la presencia de los KCNE1-4 en L6E9. En el caso de la isoforma 5, no fuimos capaces de observar la expresión en L6E9 pero sí en musculatura esquelética. Debido a la coexpresión en musculatura de las 5 isoformas de KCNE con Kv7.1 y Kv7.5 nos propusimos analizar la posible función reguladora de los KCNE sobre los Kv7. Se conoce como las diferentes KCNE modifican la actividad de Kv7.1, pero no de Kv7.5. En este trabajo determinamos que KCNE1 ralentizaba la apertura y eliminaba la inactivación de la corriente del canal KV7.5 y que KCNE3 reducía su amplitud y modificaba la velocidad de apertura de Kv7.5. Las subunidades reguladoras pueden estar regulando también el tráfico de las subunidades Kv7, en este trabajo determinamos que KCNE4 retenía el canal Kv7.5 intracelularmente. Es de interés la presecia de determinados caales iónicos en microdominios especializados de la membrana denominados lipid raft, pero no existen estudios relacionados con los Kv7 ni los KCNE. En este trabajo observamos que Kv7.1 y KCNE3 estaban en los lipid raft mientras que KV7.5 y el resto de los KCNE estaban fuera de las balsas. Los heteroligómeros KV7/KCNE a su vez poseían una distribución en superficie heterogénea, mientras que Kv7.1/KCNE1 y Kv7.1/KCNE2 se localizaban en los lipid raft, Kv7.1/KCNE3, KV7.1/KCNE4, Kv7.1/KCNE5, Kv7.5/KCNE1 y Kv7.5/KCNE3 se situarían en regiones diferentes a los lipid raft. Se conoce que Kv7.1 y Kv7.5 ser expresan en el mismo tejido (musculatura esquelética), y que Kv7.5 puede formar complejos heteroméricos con Kv7.3 (los canales Kv están como tetrámeros en la membrana), con esto nos planteamos estudiar la posible interacción entre Kv7.1 y Kv7.5 para generar un tetrámero funcional. Mediante estudios de electrofisiología en oocitos de Xenopus, de asociación en células HEK-293T y de localización en superficie, determinamos que Kv7.1 y Kv7.5 podrían estar generando un canal tratramérico en la membrana de las células musculares.