Modulación de la estructura y función de la RNasa A y de presuntas ribonucleasas prebióticas

Resumen

Índice 1. Introducción general 1.1. Introducción 11 1.2. Objetivos generales 13 1.3. Bibliografía 15 2. Material y Métodos 2.1. Estructura de proteínas 19 2.2. Estudio de proteínas mediante RMN 23 2.2.1. Espectroscopía bidimensional 24 2.2.2. Espectroscopía tridimensional 25 2.2.3. Experimentos HSQC editados en Cß y en C¿ 27 2.2.5. Experimentos de intercambio protón / deuterio 29 2.2.6. Cálculo de estructura de proteínas 30 2.3. Otras técnicas utilizadas para el estudio de proteínas 31 2.3.1. Dicroísmo circular 31 2.3.2. Cromatografía líquida de proteínas (FPLC) 32 2.3.3. Electroforesis en gel de poliacrilamida 33 2.4. La ribonucleasa A 34 2.4.1. La ribonucleasa S 36 2.4.2. Oligomerización de la ribonucleasa A 37 2.4.3. Medida de la actividad de ribonucleasas frente a ARN 39 2.5. Estructura de ácidos nucleicos 41 2.6. Bibliografía 44 3. La oligomerización de la RNasa A 3.1. Introducción 51 3.1.1. Los amiloides 51 3.1.2. La oligomerización de la RNasa A 57 3.2. La oligomerización de la RNasa S 59 3.2.1. Obtención de oligómeros 59 3.2.2. Caracterización estructural del dímero de la RNasa S 65 3.2.3. Disociación del dímero de la RNasa S 70 3.3. Mecanismo de formación de los oligómeros de la RNasa A 74 3.3.1. Caracterización mediante espectroscopía UV y dicroísmo circular 74 3.3.2. Caracterización mediante RMN 77 3.3.3. Caracterización de péptidos de la RNasa A en 40% de ácido acético 87 3.3.4. Dependencia de la concentración en la formación de oligómeros 90 3.3.5. Posible mecanismo de oligomerización de la RNasa A 91 3.3.6. Cinética de plegamiento y desplegamiento de la RNasa A 95 3.4. Bibliografía 98 Índice 8 4. Hacia ribonucleasas más eficaces y específicas 4.1. Introducción 108 4.1.1. Las ribonucleasas como agentes antitumorales 108 4.1.2. Ribonucleasas semisintéticas 111 4.2. Modulando la especificidad: Conjugados RNasa-oligonucleótido 114 4.2.1. Formación de conjugados RNasa-ADN y RNasa-PNA 114 4.2.2. Caracterización de los conjugados (dT)nRNasa mediante RMN 115 4.2.3. Actividad de los conjugados de RNasa A 117 4.3. Aumentando la eficacia: Estabilización del C-dímero de la RNasa 128 4.3.1. Elección del EDC como agente de entrecruzamiento 128 4.3.2. Posibles grupos diana de la reacción 132 4.3.3. Reacción del C-dímero de la RNasa A con EDC 134 4.3.4. Aislamiento y caracterización de los productos 135 4.3.5. Actividad ribonucleolítica 145 4.4. Bibliografía 149 5. KIA7H: Una presunta ribonucleasa prebiótica 5.1. Introducción 156 5.1.1. El origen de la vida 156 5.1.2. Los péptidos KIA7 161 5.2. Estructura de los péptidos KIA7 162 5.2.1. Plegamiento y estabilidad conformacional 162 5.2.2. Estructura terciaria y cuaternaria de KIA7H y KIA7W 167 5.3. Actividad de los péptidos KIA7 171 5.3.1. Actividad frente a una horquilla de ARN 171 5.3.2. Actividad frente a un ARN de transferencia 180 5.3.3. Actividad frente a un ARN que no forma horquillas 182 5.3.4. Posible mecanismo de corte 184 5.4. Implicaciones para la vida primitiva 187 5.5. Bibliografía 188