Identification, prediction and engineering of industrially-relevant versatile enzymesTaking advantage of biodiversity through metagenomics

Resumen

Las enzimas son catalizadores naturales que pueden ser de utilidad en el sector industrial, ya que contribuyen a hacer que algunos procesos, como aquellos relacionados con empresas de los sectores alimentación, agrícola, cosmético y farmacéutico, sean más rápidos, más limpios, más seguros, más baratos y más sostenibles. Su uso puede contrarrestar problemas globales derivados de la sobrepoblación como la disminución de recursos naturales, la polución y los problemas de salud, que a su vez demandan enzimas con nuevas y/o mejores propiedades. Encontrar nuevas enzimas es un proceso largo y complejo, si bien el tiempo necesario para su descubrimiento se ha reducido significativamente: actualmente, es posible proporcionar a la industria nuevas soluciones enzimáticas en menos de tres años. La mayoría de las enzimas son aisladas de microorganismos y los últimos avances tecnológicos hacen que sea relativamente fácil producir nuevas enzimas. El problema estriba en que solo un pequeño porcentaje de estas nuevas enzimas es útil para los procesos industriales. Este ha sido uno de los retos de esta Tesis, aumentar el valor de nuevas enzimas y ayudar a comprender, predecir y modificar sus propiedades, para encontrar candidatos de interés para la industria. Primero, nos propusimos encontrar nuevas enzimas a partir de un amplio muestrario de comunidades microbianas y microorganismos filogenéticamente diversos, que se desarrollan en ambientes heterogéneos, incluyendo algunos de los más extremos del planeta. Esto garantiza una amplia diversidad enzimática y que las enzimas aisladas se encuentren adaptadas a trabajar en múltiples condiciones de pH, temperatura, salinidad y diversidad y concentración de nutrientes, por citar algunas de las más relevantes. Segundo, esta Tesis centra su atención en encontrar y aumentar el valor de nuevas enzimas para la industria, especialmente en las llamadas enzimas de amplia “promiscuidad de sustrato”, aquellas que son capaces de aceptar una gran diversidad de sustratos y que, por lo tanto, pueden ser usadas en varios procesos industriales. Centrándonos en éster-hidrolasas y ω-transaminasas de la clase III y aplicando y diseñando herramientas de cribado y tecnologías de alto rendimiento, hemos construido una de las mayores colecciones de estas enzimas localizadas en un solo laboratorio, que actualmente asciende a 155 (145 y 10, respectivamente). Gracias a su intensa caracterización con al menos 130 sustratos diferentes, se ha evaluado la especificidad y selectividad de sustrato, e identificado aquellas con características más prominentes. Con la ayuda de las estructuras y herramientas computacionales, se han identificado marcadores de “promiscuidad de sustrato” y enantio-selectividad, a partir de los cuales hemos sido capaces de acelerar la identificación de éster-hidrolasas y ω-transaminasas de la clase III versátiles e industrialmente relevantes, en la medida en que presentan especificidades de sustrato y selectividades mayores y poco frecuentes en comparación con enzimas comerciales similares. A continuación, se demostró que es posible transformar una enzima con amplia “promiscuidad de sustrato” pero no estéreo-específica en un biocatalizador estéreo-específico con amplia especificidad de sustrato aplicando técnicas de ingeniería supramolecular e ingeniería de proteínas. Los principales logros de esta Tesis incluyen: I) la generación de un set robusto de metadatos que demuestran que la biodiversidad ambiental es una valiosísima fuente de enzimas novedosas; II) la acumulación de datos que demuestran que es posible identificar enzimas con alta “promiscuidad de sustrato” y que, a su vez, son más comunes de lo esperado; III) la demostración de que el nivel de “promiscuidad de sustrato” de ciertos tipos de enzimas puede ser predicha a partir del análisis de sus secuencias, sus modelos tridimensionales y/o sus estructuras, sin necesidad de su clonación, expresión y caracterización previa; IV) reforzar la idea de que una amplia especificidad de sustrato va ligada a una baja enantio-selectividad, si bien este hecho puede solventarse mediante ingeniería supramolecular, restringiendo la flexibilidad de la estructura de la enzima mediante estrategias de inmovilización; V) la demostración de que es posible introducir un segundo centro activo a una enzima localizando previamente nuevos sitios de unión al sustrato, y que generar una enzima con dos centros activos funcionales podría mejorar la competitividad y las propiedades catalíticas de los biocatalizadores.