Novel surface engineering approaches for protein crystallization and structural insights into the enzymes of reverse transsulfuration from the human pathogens Toxoplasma gondii and Pseudomonas aerugin

Resumen

Esta tesis doctoral, realizada en dos instituciones vascas de excelencia, CIC-bioGUNE y Tekniker, ha abordado un proyecto dividido en dos apartados complementarios:- El primer apartado, fue desarrollado principalmente en las instalaciones de Tekniker y posteriormente ensayado en CIC bioGUNE. Su objetivo era desarrollar un material polimérico avanzado cuya superficie de recubrimiento favorezca la nucleación y cristalización de proteínas de gran interés biomédico. La cristalografía de macromoléculas es actualmente la técnica más potente para determinar la estructura tridimensional de las proteínas a resolución atómica. Sin embargo, a pesar del enorme nivel de desarrollo técnico alcanzado, sigue estando limitada por la gran dificultad de obtener cristales que, tras su exposición a los rayos X, permitan obtener un patrón de difracción de alta resolución a partir del cual se pueda determinar la estructura de la proteína objetivo. Incluso hoy en día, el proceso de cristalización es un procedimiento de ensayo y error que requiere un enorme esfuerzo experimental y un elevado coste económico. Esta parte de la tesis se ha centrado enel desarrollo de topografías superficiales multiescalares (micro y submicrométricas) sobre policarbonato que actúan como un agente heteronucleante que favorece, potencia o induce el crecimiento de cristales de proteínas. El uso de estos polímeros permitió mejorar la resolución de algunos de los cristales que se describen en la siguiente sección.- La segunda sección del proyecto, fue desarrollada íntegramente en el CIC-bioGUNE. Su principal objetivo fue la caracterización cristalográfica de las dos enzimas de la vía de transulfuración inversa de dos patógenos humanos: Toxoplasma gondii y Pseudomonas aeruginosa. La vía de la transulfuración es un proceso metabólico que implica la interconversión de homocisteína y cisteína a través del intermediario cistationina. La primera enzima de la vía, la cistationina ß-sintasa, cataliza la condensación de la L-serina con la L-homocisteína para formar cistationina. La segunda enzima, la cistationina ¿-liasa, hidroliza la cistationina produciendo cisteína, ¿-cetobutirato y amonio. Ambas enzimas catalizan reacciones alternativas que conducen a la biosíntesis del sulfuro de hidrógeno (H2S), un importante gasotransmisor asociado a numerosas patologías, entre ellas los trastornos neurológicos y diversos cánceres. Recientemente, se ha demostrado que la inactivación de estas enzimas en bacterias multirresistentes y organismos patógenos aumenta su sensibilidad al estrés oxidativo y a diversos antibióticos (en el caso de las bacterias). Por lo tanto, la información estructural obtenida en este trabajo es clave para entender la implicación de la vía de transulfuración en la regulación de la homeostasis redox intracelular en patógenos y facilitará el diseño racional guiado por la estructura de inhibidores específicos.