E2F1 eta E2F2 transkripzio faktoreen parte-hartzea obesitatearekin loturiko hepatokartzinomaren garapenean

Resumen

Sarrera eta helburuak.. Munduko Osasun Erakundearen (OME) arabera, obesitatea osasun-egoeraren kontrako arriskua da, zeinak gorputzean gehiegizko gantz-pilaketa duen bereizgarritzat eta zeinaren munduko prebalentzia ia hirukoiztu egin den azken 40 urteetan, bai garatutako bai garatu-gabekoherrialdeetan. Gibeleko metabolismoaren asaldurekin lotuta dago, zeinak gibel lipidoen metaketan eta gibel koipetsuaren gaixotasun ez-alkoholikoaren (NAFLD) progresioa ahalbidetzen duten.NAFLDaren ezaugarria esteatosia edo gibel koipetsu ez-alkoholikoa da, egoera bat zeinean gibeleko TG eduki altua lipidoen pilaketan (batez ere, serumeko gantz azidoen (GA) barneratzea eta de novo lipogenesia edo DNL) eta deuseztatze bideen (batik bat, lipidoen oxidazioa edo GAOa eta dentsitate oso baxuko lipoproteinen edo VLDLren kanporaketa) arteko konpentsazio ezak bideratzen duen. Egun, NAFLDa kartzinoma hepatozelularraren (HCC) arrisku-faktore garrantzitsua da. Esteatosiaren baitan garatzen den HCCak NAFLDarekin loturiko HCCa izena du eta ezaugarri bereizgarriak ditu (lipido metaketa eta hantura, esaterako) beste etiologia batzuetatik garatutako HCCekin alderatuz gero. HCCan gene-gidari asko daude, tumore-histologiari, zelularen seinalizazio-bidezidorrei eta berprogramazio metabolikoari dagokion ezaugarri hain heterogeneoak azaltzen dituena. NAFLDarekin loturiko HCCaren fenotipoari dagokionez, nabarmentzekoa da obesitateak, berez, asaldura metabolikoak ahalbidetzen dituela, metabolikoki osasuntsua (MHO) den eta ez-osasuntsua den paziente obesoen (MUO) arteko bereizmena egiten duen sinadura metaboliko batekin erlazionatu baita.E2F trankripzio faktoreen familia, tipikoki ziklo zelularraren erregulatzailea dena, aldaketa metabolikoen arduraduna da ere, zeinak gibeleko egoera patologikoetan eta horri loturiko konplikazio metabolikoetan (obesitatea eta diabetesa, adibidez) gertatzen diren. E2F faktoreetako nahasmenduak deskribatu dira HCCan, gibeleko minbizian duten garrantzia nabarmentzen duena. Ikerketa gehienak E2F1ean oinarritzen dira, azterlanaren arabera, onkogene edo tumore-ezabatzaile moduan deskribatzen dena. E2F2aren kasuan, gehienetan E2F1aren antzekotasun funtzionalarekin erlazionatu izan da. Alabaina, hainbat ikerketek ezagutzera eman dute prozesu batzuk konpartitzen dituzten arren, funtzio batzuk batarenak edo bestearenak direla bakarrik. Ikerkuntza gehiago behar da E2F1 eta E2F2ren arteko mekanismo komunak eta propioak bereiztu ahal izateko, baita NAFLDarekin loturiko HCCan duten eragina zehazteko ere.Hori dena kontuan hartuta, proposatu genuen E2F1ak eta E2F2ak obesitateari loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran parte hartzen duten bidezidor metabolikoak erregulatzen dituztela. Testuinguru horretan, lan honen xede nagusiak izan ziren: 1) Ikertzea E2F1ak edota E2F2ak parte hartzen duten obesitarearekin loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCaren bilakaeran; 2) E2F1ak edota E2F2ak gidatzen dituzten asaldura metabolikoen mekanismoak identifikatzea NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran; 3) E2F1 eta E2F2 obesitatearekin erlazionatutako NAFLDaren biomarkatzaile goiztiar moduan baliozkotzea.Prozedura esperimentalak. Animali ereduak E2f1 knockout (E2f1-/-), E2f2 knockout (E2f2-/-) eta zegokien sagu basati (WT) (129/Sv x C57BL/6) arrak izan ziren. Gibelarentzako kartzinogenikoa den dietilnitrosamina (DEN) intraperitonealki ziztatu zitzaien jaio-osteko 14. egunean eta, titia kendu ondoren, gantzetan aberatsa den dietarekin (HFD) (DEN HFD izeneko taldea) edo oinarrizko dietarekin (DEN CD izeneko taldea) elikatu ziren sakrifikatu ziren arte 3 hilabeterekin NAFLDa ikertzeko edo 9 hilabeterekin HCCa ikertzeko. E2f1 eta E2f2 geneen gibeleko adierazpena analizatu zen gibeleko gaixotasunaren fase ezberdinetan WT saguetan. Ikerketa-talde guztietan, gorputzeko hainbat parametroeta janari kontsumoa jaso ziren, gibeleko mina neurtu zen, gibeleko eta serumeko profil lipidikoa analizatu zen, baita gibeleko histologia, fibrosi maila, ziklo zelularraren aktibazioa eta intsulinarekiko erresistentzia (IR). 9 hilabetetako E2f2-/- saguetan, gene adierazpenaren profila ebaluatu zen eta, bai 3 bai 9 hilabetetako E2f2-/- saguetan, gibeleko lipidoen hornitzean eta eliminazioan parte hartzen duten bidezidorren fluxu metabolikoak analizatu ziren baita ere.E2F1 eta E2F2 siRNA bidez isilarazi zen HepG2 giza hepatoma zelula-lerroan, triglizerido (TG) edukia eta bere sintesian eta degradazioko fluxu metabolikoak neurtzeko.Azkenik, E2F1 eta E2F2aren adierazpena ebaluatu zen pazienteen gibel-biopsietan, aurretik histologikoki gibel normala (NL) edo NAFLDa zuten taldeetan klasifikatu zirenak.Emaitzak. Gorputzeko pisuaren neurketak eta gantz ehun zuriaren (GEZ) indizeak erakutsi zuten HFD dietak obesitatea induzitu zuela 3 hilabetetako saguetan eta baldintza hori areagotu zela saguak zaharragoak ziren heinean. Bereziki, gorputz-pisuaren handitzea ez zen janari-kontsumoa areagotzearen ondoriozkoa izan. Lipido-edukiaren azterketak erakutsi zuen efektu hori gibeleko triglizerido (TG), diglizerido (DG) eta kolesteril esterren (CE) pilaketarekin bat zetorrela, hots, NAFLDaren garapenarekin. HFD elikatzeak NAFLD-HCCren bilakaera ere sustatu zuen sagu-ereduetan. Aitzitik, emaitzek erakutsi zuten DENak induzitutako HCCa ez zegoela obesitatearekin edo NAFLDaren garapenarekin lotuta. Bakarrik HFDa ematea tratamendu kartzinogenikorik txikiena izan zen, hala ere, lipidoetan aberatsa den dieta batekin elikatzeak DENak induzitutako HCCa areagotu zuen tumore kantitateari eta tamainari dagokionez. Ezaugarri histopatologikoekin bat, gibeleko lipidoen metaketa (TG eta CE moduan) nabaria zen NAFLD-HCCa garatu zuten eta DEN HFD ezarri zitzaien saguetan.Emaitzek erakutsi zutenez, E2f2ak goranzko erregulazioa izan zuen obesitatearekin loturiko NAFLD eta NAFLD-HCC garatu zuten saguetan bakarrik, E2f2 obesitatean induzitzen dela adieraziz gibeleko gaixotasunaren hasierako faseetatik. Hori gibeleko E2F1 eta E2F2ak paziente obesoetan zuten adierazpen areagotuarekin erlazionatzen da, gibeleko gaixotasuna ez zutenean ere ematen den egoera. Horrela, E2F1 eta E2F2ak gibeleko gaixotasunaren iragarletzat duten balioa aditzera ematen da. Nabarmenki, E2F2aren gainadierazpena oraindik handiagoa izan zen behin NAFLDa garatuta zegoela paziente obesoetan, zeinak MUO bezala sailkatzeko irizpideak betetzen zituzten eta beraz, MUO pazienteak E2F2 edukiaren bidez ezberdintzea baimenduko luke.E2f1 eta E2f2ak obesitatearekin loturiko gibelaren gaixotasunean eginkizun bat zutela zehaztu ondoren (E2F1 eta E2F2aren mailak paziente obesoen eta saguen egoera metabolikoan zuten efektuaren bidez), E2f1 eta E2f2aren zereginak ikertu ziren NAFLDaren eta NAFLD-HCCaren agerpenean eta bilakaeran. E2f1-/- eta bereziki E2f2-/- saguek tratamendu guztiengatik induzitutako tumoreen garapena ia guztiz ekidin zutela behatu genuen, E2f1 eta, batik bat, E2f2ren absentziak tratamenduek induzitutako hepatokartzinogenesiarekiko babesa ematen dutela adieraziz. Analisi histokimikoak eta lipidoen kuantifikazioak frogatu zutenez, E2f1 eta E2f2aren faltak gibeleko lipidoen metaketa ekidin zuen HCC induzitzeko tratamenduei erantzunez. Antzeko profil metabolikoa nabarmendu zen giza-HCCaren zelulalerroetan E2F2 isilarazi zenean, baina ez E2F1 isilaraztean. E2f1 eta bereziki E2f2ren defizientziak 3 hilabetetan garatutako hepatoesteatositik babestu zituen saguak baita ere, ziklo zelularra aktibo ez zegoenean, E2f1 eta E2f2ren eginkizun metabolikoa aditzera ematen duena. NAFLD aurrerakoiaren prebentzioarekin bat, gene adierazpenak eta analisi histokimikoak jakinarazi zuten E2f1 eta E2f2ren absentziak eragozten zituela bai Tfgb1-bidezko fibrosia bai Il1b-bidezko hantura, zeinak obesitatearekin loturiko NAFLD eta NAFLD HCCaren azterketa-ereduetan nabarmen ziren.E2f2ren parte-hartzea obesitatearekin loturiko gibel-gaixotasunaren garapenean E2f1arena baino garrantzitsuagoa izan zen, beraz, E2f2ren absentziak zuen NAFLD-HCCa garatzeko erresistentziarekin loturiko transkripzio-programa ikertu genuen. Bertatik ezagutu genuen esanguratsuki gehien gainadierazi ziren geneak lipidoen katabolismoan eta energia ekoizpenean taldekatzen zirela, HCCan tipikoki induzitzen diren bidezidorrak hain zuzen ere. Bestalde, beheranzko adierazpena zuten locusak ziklo zelularrarekin, apoptosiarekin eta lipidoen sintesiarekin erlazionatzen ziren. Hori guztia bat dator E2f2ren absentziak NAFLDa eta erlazionatutako HCCa ez garatzeko saguetan ematen duen babesarekin.Mikroarrayeko datuetan oinarrituz, gibeleko lipidoen sustatzean eta irteeran jarduten duten bidezidorrak analizatu ziren. Lipidoen deuseztatze-bideei dagokienez, E2F2ren defizientzia GAen oxidazio (GAO) maila altuekin erlazionatu zen giza-tumore zeluletan eta saguen gibeletan, ß-oxidazioaren erreakzioetako eta GAen aktibazioko geneen handitutako adierazpenarekin batera. Bereziki, GAOren pausu mugatzailean parte hartzen duen eta obesitatean hepatokartzinogenesiaren sustatzaile den CTP2 gene eta proteinaren adierazpenak beheranzko erregulazioa zuen NAFLD eta NAFLD-HCCaren sagu-ereduetan eta goranzko erregulazioa zuen E2f2 defizientea zenean. Gainera, NAFLDan eta NAFLD-HCCan gertatzen denaren kontrara, E2f2ren absentzia HNF4-¿-ren gainadierazpenarekin erlazionatuta zegoen, hartzaile nuklear bat zeina GAOa eragiten duen eta HCCaren inhibizioan zeregin bat duen. Hortaz, emaitzek iradokitzen dute E2f2ak gibel-gaixotasuna garatzetik eskaintzen duen babesean jarduten duen mekanismo nagusietako bat areagotutako GAOa dela, zeina handitutako mitokondrioarekiko GAen garraioaren bidez ematen den. Zelulek ATP gehiago behar izatekotan, GAOtik eta azido trikarboxilikoaren ziklotik (ATZ) eskuratutako ahalmen erreduzitzailea fosforilazio oxidatzailera (oxphos) bideratzen da. Prozesu horrekin erlazionatutako hainbat genek adierazpen baxua zutela behatu genuen obesitatearekin lotutako HCCan eta induzituta zeudela E2f2an defizienteak ziren saguen gibeletan. Oxphosa gidatzen duen eta obesitateak induzitutako esteatosia erregulatzen duen PGC-1ß-ren adierazpen patroia antzekoa zen.Lipidoen hornitze bideei dagokionez, [3H]-glizerolaren eta GAen esterifikazioaren emendapenak, PPAR-¿ gene eta proteinaren baita lipidoen garraioan eta biltzean jarduten duten bere itu geneen gainadierazpenarekin batera, adierazten dute TGaren biosintesia NAFLDa eta HCCarekiko bilakaera sustatzen duen beste mekanismo bat dela. DEN HFD tratamendua ezarritako E2f2 gabeko saguen gibeletan, parametro guzti horiek gutxiegituta zeuden, iradokitzen duenak E2f2ren absentziak tratamenduak induzitutako lipogenesia galarazten duela. [3H]-azetatoarekin ebaluatutako TGaren de novo lipogenesia (DNL) ez zegoen aldatuta DEN HFD ezarritako E2f2-/- saguetan, E2f2ren faltarekinerlazionatutako TGaren biosintesi murriztua esterifikazioaren asalduragatik izan zela adieraziz eta ez DNL gutxiagotzeagatik.Emaitzek iradoki zuten dislipemiak garrantzia handia zuela NAFLDan eta HCCarekiko bere bilakaeran, izan ere, TG eta GA serikoen maila handiagotua zegoen DEN HFD ezarritako saguetan. Aitzitik, dislipemia ez zuen VLDLren gibeleko kanporaketaren asaldurak eragin, gibeleko VLDL jariapena baita Apob eta Apoeren adierazpenak aldatu gabe mantendu zirelako. GEZaren lipolisia, energia premian gibelaren eta gantz-ehunak ez direnen GA hornitzailea, ez zen parte-hartzen zuen bidezidorra ezta ere, GEZaren indizea handituta baitzegoen obesitatearekin loturiko NAFLDa zuten WT saguetan kontrolekin alderatuz gero. NAFLD eta NAFLD-HCCa garatu zuten saguetan serumeko lipido-profila asaldatuta egon arren, goratutako Lpl adierazpenak iradokitzen du serumeko TGaren gibeleko katabolismoa handituta zegoela, gibelean lipido metaketa eta HCCa garatzea ahalbidetzen duen egoera. E2F2ren zereginari dagokionez, emaitzek adierazten dute E2f2ren absentziak saguak dislipemiatik eta odol-TGaren gibeleko ezabatzetik babesten dituela. Izan ere, GA eta TG serikoen maila ez zen altua baldintza proesteatotikoak ezarritako E2f2-/- saguetan, nahiz eta GEZaren lipolisia handituta egon, GEZ indizea txikiagotua eta gibeleko Lpl adierazpenaren erregulazioa baxuagoa izan.Orohar, gibeleko GAOa, lipidoen sintesia eta TGen xurgapena, obesitatearekin loturiko HCCan nahasita dauden bidezidorrak dira eta asaldatuta daude gibeleko gaixotasunaren fase goiztiarretan baita ere, E2F2 gainadierazita dagoen egoera hain zuzen. Jakinik E2f2ren ezabatzeak NAFLD aurrerakoiarekin erlazionatutako profil metabolikotik saguak babesten zituela, iradokitzen dugu E2F2ak NAFLDari loturiko HCCa baino lehenago gertatzen den metabolismoaren moldaketa gidatzen duela. Aurkikuntza honen garrantzia E2F2 obesitatearekin erlazionatutako gibel-gaixotasunaren biomarkatzaile goiztiarra izatean datza.Azkenik, obesitatearen eta NAFLDaren konplikazio metabolikoek II motako diabetes mellitusa (IIMDM) barruan hartzen dute, zeina intsulinarekiko erresistentziatik (IR) eratortzen den eta NAFLD pazienteetan HCCa pairatzeko arriskua handitzen duen egoera. Gainera, jadanik deskribatuta dago E2F1ak glukosaren homeostasia mantentzean eta diabetesa ekiditean jarduten duela. Beraz, jakin nahi izan genuen NAFLDaren fase goiztiarrean eta HCCrako bilakaerak IRa ahalbidetzen bazuen eta E2f1 edota E2f2ak horretan zereginik bazuten. Dagokien tolerantzia testek erakutsi zuten IRa garatu zela DENarekin konbinaturiko edo ez konbinaturiko HFD dieta laburra ezartzeagatik NAFLDa zuten WT sagu obesoetan, dietak-induzitutako egoera dela adieraziz. E2f1 eta E2f2ren absentziak NAFLDa induzitzeko tratamentuari loturiko IRa garatzea saihestu zuten saguetan, baina ez NAFLD-HCCa induzitzeko tratamenduari erlazionaturikoa.Ondorioak1. E2F1 eta, bereziki, E2F2 transkripzio faktoreek obesitateari loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran jarduten dute.1.1. Bai E2F1 bai E2F2 gainadierazita daude NAFLDa duten paziente obesoetan eta E2f2 gainadierazita dago baita ere obesitatearekin erlazionatutako NAFLDaren eta NAFLDariloturiko HCCaren sagu-ereduetan, zeinak transkripzio faktore hauek proesteatotikoak eta onkogenikoak direla iradokitzen duen.1.2. E2f1 eta, batik bat, E2f2aren absentziak obesitatearekin loturiko NAFLDaren garapena prebenitzen du. E2f1 edo E2f2 faltan duten saguek ez dute hepatoesteatosirik ezta NAFLDren indukzio-tratamenduek eragindako gibel-hanturarik, transkripzio faktore hauek obesitatearekin lotutako NAFLDan premiazkoak direla erakutsiz.1.3. E2f1 eta E2f2aren defizientziak erresistentzia ematen du NAFLDarekin loturiko HCCarekiko eta horrekin erlazionatutako fibrosiarekiko eta lipido metaketarekiko, bai E2f1 bai E2f2a prozesu horietan beharrezkoak direla adieraziz.2. E2f2 transkripzio faktoreak obesitatearekin loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCarekiko bilakaeran ematen den berprogramazio metabolikoa koordinatzen du.2.1. E2f2ak gibeleko lipido-biltegiratzean ekiten duten bidezidor metabolikoak kontrolatzen ditu gibel-gaixotasunaren fase goiztiarretik. Babes mekanismo bezala, saguetako E2f2aren defizientziak NAFLD eta NAFLD-HCCarekin lotutako dislipemia eta areagotutako TGen sintesia baita xurgapena saihesten ditu. Bestalde, handitutako GAOak NAFLDarekiko eta HCCarekiko erresistentzia ahalbidetzen du E2f2 knockout saguetan, areagotutako mitokondrioarekiko GAen garraioaren bidez.2.2. Profil lipidikoa hobetzeaz gain, E2f2aren defizientziak obesitatearekin lotutako NAFLDaren fase goiztiarretako IRa prebenitzen du saguetan, baina ez NAFLD-HCCarekin erlazionaturikoa.3. E2F1 eta, batez ere, E2F2a obesitatearekin lotutako NAFLDaren markatzaile prognostiko eta potentzialak dira. E2F1 eta E2F2 NAFLDa duen ala ez duen obesitatean induzitzen dira. Gainera, gibeleko E2F2 edukiaren handitzea oraindik ere nabarmenagoa da NAFLD garatzen denean. // Sarrera eta helburuak.. Munduko Osasun Erakundearen (OME) arabera, obesitatea osasun-egoeraren kontrako arriskua da, zeinak gorputzean gehiegizko gantz-pilaketa duen bereizgarritzat eta zeinaren munduko prebalentzia ia hirukoiztu egin den azken 40 urteetan, bai garatutako bai garatu-gabekoherrialdeetan. Gibeleko metabolismoaren asaldurekin lotuta dago, zeinak gibel lipidoen metaketan eta gibel koipetsuaren gaixotasun ez-alkoholikoaren (NAFLD) progresioa ahalbidetzen duten.NAFLDaren ezaugarria esteatosia edo gibel koipetsu ez-alkoholikoa da, egoera bat zeinean gibeleko TG eduki altua lipidoen pilaketan (batez ere, serumeko gantz azidoen (GA) barneratzea eta de novo lipogenesia edo DNL) eta deuseztatze bideen (batik bat, lipidoen oxidazioa edo GAOa eta dentsitate oso baxuko lipoproteinen edo VLDLren kanporaketa) arteko konpentsazio ezak bideratzen duen. Egun, NAFLDa kartzinoma hepatozelularraren (HCC) arrisku-faktore garrantzitsua da. Esteatosiaren baitan garatzen den HCCak NAFLDarekin loturiko HCCa izena du eta ezaugarri bereizgarriak ditu (lipido metaketa eta hantura, esaterako) beste etiologia batzuetatik garatutako HCCekin alderatuz gero. HCCan gene-gidari asko daude, tumore-histologiari, zelularen seinalizazio-bidezidorrei eta berprogramazio metabolikoari dagokion ezaugarri hain heterogeneoak azaltzen dituena. NAFLDarekin loturiko HCCaren fenotipoari dagokionez, nabarmentzekoa da obesitateak, berez, asaldura metabolikoak ahalbidetzen dituela, metabolikoki osasuntsua (MHO) den eta ez-osasuntsua den paziente obesoen (MUO) arteko bereizmena egiten duen sinadura metaboliko batekin erlazionatu baita.E2F trankripzio faktoreen familia, tipikoki ziklo zelularraren erregulatzailea dena, aldaketa metabolikoen arduraduna da ere, zeinak gibeleko egoera patologikoetan eta horri loturiko konplikazio metabolikoetan (obesitatea eta diabetesa, adibidez) gertatzen diren. E2F faktoreetako nahasmenduak deskribatu dira HCCan, gibeleko minbizian duten garrantzia nabarmentzen duena. Ikerketa gehienak E2F1ean oinarritzen dira, azterlanaren arabera, onkogene edo tumore-ezabatzaile moduan deskribatzen dena. E2F2aren kasuan, gehienetan E2F1aren antzekotasun funtzionalarekin erlazionatu izan da. Alabaina, hainbat ikerketek ezagutzera eman dute prozesu batzuk konpartitzen dituzten arren, funtzio batzuk batarenak edo bestearenak direla bakarrik. Ikerkuntza gehiago behar da E2F1 eta E2F2ren arteko mekanismo komunak eta propioak bereiztu ahal izateko, baita NAFLDarekin loturiko HCCan duten eragina zehazteko ere.Hori dena kontuan hartuta, proposatu genuen E2F1ak eta E2F2ak obesitateari loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran parte hartzen duten bidezidor metabolikoak erregulatzen dituztela. Testuinguru horretan, lan honen xede nagusiak izan ziren: 1) Ikertzea E2F1ak edota E2F2ak parte hartzen duten obesitarearekin loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCaren bilakaeran; 2) E2F1ak edota E2F2ak gidatzen dituzten asaldura metabolikoen mekanismoak identifikatzea NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran; 3) E2F1 eta E2F2 obesitatearekin erlazionatutako NAFLDaren biomarkatzaile goiztiar moduan baliozkotzea.Prozedura esperimentalak. Animali ereduak E2f1 knockout (E2f1-/-), E2f2 knockout (E2f2-/-) eta zegokien sagu basati (WT) (129/Sv x C57BL/6) arrak izan ziren. Gibelarentzako kartzinogenikoa den dietilnitrosamina (DEN) intraperitonealki ziztatu zitzaien jaio-osteko 14. egunean eta, titia kendu ondoren, gantzetan aberatsa den dietarekin (HFD) (DEN HFD izeneko taldea) edo oinarrizko dietarekin (DEN CD izeneko taldea) elikatu ziren sakrifikatu ziren arte 3 hilabeterekin NAFLDa ikertzeko edo 9 hilabeterekin HCCa ikertzeko. E2f1 eta E2f2 geneen gibeleko adierazpena analizatu zen gibeleko gaixotasunaren fase ezberdinetan WT saguetan. Ikerketa-talde guztietan, gorputzeko hainbat parametroeta janari kontsumoa jaso ziren, gibeleko mina neurtu zen, gibeleko eta serumeko profil lipidikoa analizatu zen, baita gibeleko histologia, fibrosi maila, ziklo zelularraren aktibazioa eta intsulinarekiko erresistentzia (IR). 9 hilabetetako E2f2-/- saguetan, gene adierazpenaren profila ebaluatu zen eta, bai 3 bai 9 hilabetetako E2f2-/- saguetan, gibeleko lipidoen hornitzean eta eliminazioan parte hartzen duten bidezidorren fluxu metabolikoak analizatu ziren baita ere.E2F1 eta E2F2 siRNA bidez isilarazi zen HepG2 giza hepatoma zelula-lerroan, triglizerido (TG) edukia eta bere sintesian eta degradazioko fluxu metabolikoak neurtzeko.Azkenik, E2F1 eta E2F2aren adierazpena ebaluatu zen pazienteen gibel-biopsietan, aurretik histologikoki gibel normala (NL) edo NAFLDa zuten taldeetan klasifikatu zirenak.Emaitzak. Gorputzeko pisuaren neurketak eta gantz ehun zuriaren (GEZ) indizeak erakutsi zuten HFD dietak obesitatea induzitu zuela 3 hilabetetako saguetan eta baldintza hori areagotu zela saguak zaharragoak ziren heinean. Bereziki, gorputz-pisuaren handitzea ez zen janari-kontsumoa areagotzearen ondoriozkoa izan. Lipido-edukiaren azterketak erakutsi zuen efektu hori gibeleko triglizerido (TG), diglizerido (DG) eta kolesteril esterren (CE) pilaketarekin bat zetorrela, hots, NAFLDaren garapenarekin. HFD elikatzeak NAFLD-HCCren bilakaera ere sustatu zuen sagu-ereduetan. Aitzitik, emaitzek erakutsi zuten DENak induzitutako HCCa ez zegoela obesitatearekin edo NAFLDaren garapenarekin lotuta. Bakarrik HFDa ematea tratamendu kartzinogenikorik txikiena izan zen, hala ere, lipidoetan aberatsa den dieta batekin elikatzeak DENak induzitutako HCCa areagotu zuen tumore kantitateari eta tamainari dagokionez. Ezaugarri histopatologikoekin bat, gibeleko lipidoen metaketa (TG eta CE moduan) nabaria zen NAFLD-HCCa garatu zuten eta DEN HFD ezarri zitzaien saguetan.Emaitzek erakutsi zutenez, E2f2ak goranzko erregulazioa izan zuen obesitatearekin loturiko NAFLD eta NAFLD-HCC garatu zuten saguetan bakarrik, E2f2 obesitatean induzitzen dela adieraziz gibeleko gaixotasunaren hasierako faseetatik. Hori gibeleko E2F1 eta E2F2ak paziente obesoetan zuten adierazpen areagotuarekin erlazionatzen da, gibeleko gaixotasuna ez zutenean ere ematen den egoera. Horrela, E2F1 eta E2F2ak gibeleko gaixotasunaren iragarletzat duten balioa aditzera ematen da. Nabarmenki, E2F2aren gainadierazpena oraindik handiagoa izan zen behin NAFLDa garatuta zegoela paziente obesoetan, zeinak MUO bezala sailkatzeko irizpideak betetzen zituzten eta beraz, MUO pazienteak E2F2 edukiaren bidez ezberdintzea baimenduko luke.E2f1 eta E2f2ak obesitatearekin loturiko gibelaren gaixotasunean eginkizun bat zutela zehaztu ondoren (E2F1 eta E2F2aren mailak paziente obesoen eta saguen egoera metabolikoan zuten efektuaren bidez), E2f1 eta E2f2aren zereginak ikertu ziren NAFLDaren eta NAFLD-HCCaren agerpenean eta bilakaeran. E2f1-/- eta bereziki E2f2-/- saguek tratamendu guztiengatik induzitutako tumoreen garapena ia guztiz ekidin zutela behatu genuen, E2f1 eta, batik bat, E2f2ren absentziak tratamenduek induzitutako hepatokartzinogenesiarekiko babesa ematen dutela adieraziz. Analisi histokimikoak eta lipidoen kuantifikazioak frogatu zutenez, E2f1 eta E2f2aren faltak gibeleko lipidoen metaketa ekidin zuen HCC induzitzeko tratamenduei erantzunez. Antzeko profil metabolikoa nabarmendu zen giza-HCCaren zelulalerroetan E2F2 isilarazi zenean, baina ez E2F1 isilaraztean. E2f1 eta bereziki E2f2ren defizientziak 3 hilabetetan garatutako hepatoesteatositik babestu zituen saguak baita ere, ziklo zelularra aktibo ez zegoenean, E2f1 eta E2f2ren eginkizun metabolikoa aditzera ematen duena. NAFLD aurrerakoiaren prebentzioarekin bat, gene adierazpenak eta analisi histokimikoak jakinarazi zuten E2f1 eta E2f2ren absentziak eragozten zituela bai Tfgb1-bidezko fibrosia bai Il1b-bidezko hantura, zeinak obesitatearekin loturiko NAFLD eta NAFLD HCCaren azterketa-ereduetan nabarmen ziren.E2f2ren parte-hartzea obesitatearekin loturiko gibel-gaixotasunaren garapenean E2f1arena baino garrantzitsuagoa izan zen, beraz, E2f2ren absentziak zuen NAFLD-HCCa garatzeko erresistentziarekin loturiko transkripzio-programa ikertu genuen. Bertatik ezagutu genuen esanguratsuki gehien gainadierazi ziren geneak lipidoen katabolismoan eta energia ekoizpenean taldekatzen zirela, HCCan tipikoki induzitzen diren bidezidorrak hain zuzen ere. Bestalde, beheranzko adierazpena zuten locusak ziklo zelularrarekin, apoptosiarekin eta lipidoen sintesiarekin erlazionatzen ziren. Hori guztia bat dator E2f2ren absentziak NAFLDa eta erlazionatutako HCCa ez garatzeko saguetan ematen duen babesarekin.Mikroarrayeko datuetan oinarrituz, gibeleko lipidoen sustatzean eta irteeran jarduten duten bidezidorrak analizatu ziren. Lipidoen deuseztatze-bideei dagokienez, E2F2ren defizientzia GAen oxidazio (GAO) maila altuekin erlazionatu zen giza-tumore zeluletan eta saguen gibeletan, ß-oxidazioaren erreakzioetako eta GAen aktibazioko geneen handitutako adierazpenarekin batera. Bereziki, GAOren pausu mugatzailean parte hartzen duen eta obesitatean hepatokartzinogenesiaren sustatzaile den CTP2 gene eta proteinaren adierazpenak beheranzko erregulazioa zuen NAFLD eta NAFLD-HCCaren sagu-ereduetan eta goranzko erregulazioa zuen E2f2 defizientea zenean. Gainera, NAFLDan eta NAFLD-HCCan gertatzen denaren kontrara, E2f2ren absentzia HNF4-¿-ren gainadierazpenarekin erlazionatuta zegoen, hartzaile nuklear bat zeina GAOa eragiten duen eta HCCaren inhibizioan zeregin bat duen. Hortaz, emaitzek iradokitzen dute E2f2ak gibel-gaixotasuna garatzetik eskaintzen duen babesean jarduten duen mekanismo nagusietako bat areagotutako GAOa dela, zeina handitutako mitokondrioarekiko GAen garraioaren bidez ematen den. Zelulek ATP gehiago behar izatekotan, GAOtik eta azido trikarboxilikoaren ziklotik (ATZ) eskuratutako ahalmen erreduzitzailea fosforilazio oxidatzailera (oxphos) bideratzen da. Prozesu horrekin erlazionatutako hainbat genek adierazpen baxua zutela behatu genuen obesitatearekin lotutako HCCan eta induzituta zeudela E2f2an defizienteak ziren saguen gibeletan. Oxphosa gidatzen duen eta obesitateak induzitutako esteatosia erregulatzen duen PGC-1ß-ren adierazpen patroia antzekoa zen.Lipidoen hornitze bideei dagokionez, [3H]-glizerolaren eta GAen esterifikazioaren emendapenak, PPAR-¿ gene eta proteinaren baita lipidoen garraioan eta biltzean jarduten duten bere itu geneen gainadierazpenarekin batera, adierazten dute TGaren biosintesia NAFLDa eta HCCarekiko bilakaera sustatzen duen beste mekanismo bat dela. DEN HFD tratamendua ezarritako E2f2 gabeko saguen gibeletan, parametro guzti horiek gutxiegituta zeuden, iradokitzen duenak E2f2ren absentziak tratamenduak induzitutako lipogenesia galarazten duela. [3H]-azetatoarekin ebaluatutako TGaren de novo lipogenesia (DNL) ez zegoen aldatuta DEN HFD ezarritako E2f2-/- saguetan, E2f2ren faltarekinerlazionatutako TGaren biosintesi murriztua esterifikazioaren asalduragatik izan zela adieraziz eta ez DNL gutxiagotzeagatik.Emaitzek iradoki zuten dislipemiak garrantzia handia zuela NAFLDan eta HCCarekiko bere bilakaeran, izan ere, TG eta GA serikoen maila handiagotua zegoen DEN HFD ezarritako saguetan. Aitzitik, dislipemia ez zuen VLDLren gibeleko kanporaketaren asaldurak eragin, gibeleko VLDL jariapena baita Apob eta Apoeren adierazpenak aldatu gabe mantendu zirelako. GEZaren lipolisia, energia premian gibelaren eta gantz-ehunak ez direnen GA hornitzailea, ez zen parte-hartzen zuen bidezidorra ezta ere, GEZaren indizea handituta baitzegoen obesitatearekin loturiko NAFLDa zuten WT saguetan kontrolekin alderatuz gero. NAFLD eta NAFLD-HCCa garatu zuten saguetan serumeko lipido-profila asaldatuta egon arren, goratutako Lpl adierazpenak iradokitzen du serumeko TGaren gibeleko katabolismoa handituta zegoela, gibelean lipido metaketa eta HCCa garatzea ahalbidetzen duen egoera. E2F2ren zereginari dagokionez, emaitzek adierazten dute E2f2ren absentziak saguak dislipemiatik eta odol-TGaren gibeleko ezabatzetik babesten dituela. Izan ere, GA eta TG serikoen maila ez zen altua baldintza proesteatotikoak ezarritako E2f2-/- saguetan, nahiz eta GEZaren lipolisia handituta egon, GEZ indizea txikiagotua eta gibeleko Lpl adierazpenaren erregulazioa baxuagoa izan.Orohar, gibeleko GAOa, lipidoen sintesia eta TGen xurgapena, obesitatearekin loturiko HCCan nahasita dauden bidezidorrak dira eta asaldatuta daude gibeleko gaixotasunaren fase goiztiarretan baita ere, E2F2 gainadierazita dagoen egoera hain zuzen. Jakinik E2f2ren ezabatzeak NAFLD aurrerakoiarekin erlazionatutako profil metabolikotik saguak babesten zituela, iradokitzen dugu E2F2ak NAFLDari loturiko HCCa baino lehenago gertatzen den metabolismoaren moldaketa gidatzen duela. Aurkikuntza honen garrantzia E2F2 obesitatearekin erlazionatutako gibel-gaixotasunaren biomarkatzaile goiztiarra izatean datza.Azkenik, obesitatearen eta NAFLDaren konplikazio metabolikoek II motako diabetes mellitusa (IIMDM) barruan hartzen dute, zeina intsulinarekiko erresistentziatik (IR) eratortzen den eta NAFLD pazienteetan HCCa pairatzeko arriskua handitzen duen egoera. Gainera, jadanik deskribatuta dago E2F1ak glukosaren homeostasia mantentzean eta diabetesa ekiditean jarduten duela. Beraz, jakin nahi izan genuen NAFLDaren fase goiztiarrean eta HCCrako bilakaerak IRa ahalbidetzen bazuen eta E2f1 edota E2f2ak horretan zereginik bazuten. Dagokien tolerantzia testek erakutsi zuten IRa garatu zela DENarekin konbinaturiko edo ez konbinaturiko HFD dieta laburra ezartzeagatik NAFLDa zuten WT sagu obesoetan, dietak-induzitutako egoera dela adieraziz. E2f1 eta E2f2ren absentziak NAFLDa induzitzeko tratamentuari loturiko IRa garatzea saihestu zuten saguetan, baina ez NAFLD-HCCa induzitzeko tratamenduari erlazionaturikoa.Ondorioak1. E2F1 eta, bereziki, E2F2 transkripzio faktoreek obesitateari loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCrako bilakaeran jarduten dute.1.1. Bai E2F1 bai E2F2 gainadierazita daude NAFLDa duten paziente obesoetan eta E2f2 gainadierazita dago baita ere obesitatearekin erlazionatutako NAFLDaren eta NAFLDariloturiko HCCaren sagu-ereduetan, zeinak transkripzio faktore hauek proesteatotikoak eta onkogenikoak direla iradokitzen duen.1.2. E2f1 eta, batik bat, E2f2aren absentziak obesitatearekin loturiko NAFLDaren garapena prebenitzen du. E2f1 edo E2f2 faltan duten saguek ez dute hepatoesteatosirik ezta NAFLDren indukzio-tratamenduek eragindako gibel-hanturarik, transkripzio faktore hauek obesitatearekin lotutako NAFLDan premiazkoak direla erakutsiz.1.3. E2f1 eta E2f2aren defizientziak erresistentzia ematen du NAFLDarekin loturiko HCCarekiko eta horrekin erlazionatutako fibrosiarekiko eta lipido metaketarekiko, bai E2f1 bai E2f2a prozesu horietan beharrezkoak direla adieraziz.2. E2f2 transkripzio faktoreak obesitatearekin loturiko NAFLDaren garapenean eta HCCarekiko bilakaeran ematen den berprogramazio metabolikoa koordinatzen du.2.1. E2f2ak gibeleko lipido-biltegiratzean ekiten duten bidezidor metabolikoak kontrolatzen ditu gibel-gaixotasunaren fase goiztiarretik. Babes mekanismo bezala, saguetako E2f2aren defizientziak NAFLD eta NAFLD-HCCarekin lotutako dislipemia eta areagotutako TGen sintesia baita xurgapena saihesten ditu. Bestalde, handitutako GAOak NAFLDarekiko eta HCCarekiko erresistentzia ahalbidetzen du E2f2 knockout saguetan, areagotutako mitokondrioarekiko GAen garraioaren bidez.2.2. Profil lipidikoa hobetzeaz gain, E2f2aren defizientziak obesitatearekin lotutako NAFLDaren fase goiztiarretako IRa prebenitzen du saguetan, baina ez NAFLD-HCCarekin erlazionaturikoa.3. E2F1 eta, batez ere, E2F2a obesitatearekin lotutako NAFLDaren markatzaile prognostiko eta potentzialak dira. E2F1 eta E2F2 NAFLDa duen ala ez duen obesitatean induzitzen dira. Gainera, gibeleko E2F2 edukiaren handitzea oraindik ere nabarmenagoa da NAFLD garatzen denean.