Mechanisms involved in microglial phagocytic activity in brain ischemia

Resumen

La isquemia cerebral está causada por una interrupción en el aporte de oxígeno y glucosa al cerebro y constituye una de las principales causas de muerte y discapacidad en países industrializados. Tras el ictus se inicia una respuesta inflamatoria aguda que implica una serie de mecanismos entre los que se encuentran la activación microglial y la infiltración de leucocitos procedentes del sistema nervioso periférico. La microglia es una célula de origen mieloide residente del sistema nervioso central y profesional fagocítica. En etapas embrionarias tempranas las células precursoras mieloides invaden el tejido cerebral y adquieren una firma transcriptómica con fenotipo específico que las diferencian de las demás células periféricas como son los macrófagos. Entre varias funciones, la microglia es esencial para eliminar las células muertas y mantener la homesotasis celular. Esta función la realiza gracias a su actividad fagocítica, crucial después de un daño cerebral agudo como el ictus isquémico, donde se produce muerte tanto necrótica como apoptótica, además de otras formas de muerte celular neuronal que inducen una condición de inflamación estéril. En este contexto, después del ictus los neutrófilos son atraídos hacia el tejido cerebral lesionado, donde pueden dañar la integridad de la barrera hematoencefálica y exacerbar así la lesión. Sin embargo, el estudio de los mecanismos involucrados en la extravasación de neutrófilos, incluso su localización y acumulación en diferentes zonas del parénquima aún no se han dilucidado completamente. En esta tesis hipotetizamos que la función fagocítica de la microglia es relevante para la progresión de la lesión isquémica, ya que estas células fagocitan tanto neuronas muertas como células infiltrantes. Nos hemos centrado en el neutrófilo ya que son las primeras células immunes en infiltrar la zona isquémica. Sin embargo, las señales que intervienen en el proceso de reconocimiento celular del neutrófilo para su posterior fagocitosis por la microglia no se conocen con exactitud. Es por ello, que el estudio de esta función ayudará a encontrar nuevas dianas terapéuticas basadas en la modulación de la fagocitosis en un contexto de isquemia cerebral. Este estudio se ha abordado gracias al uso de diferentes cepas de ratón, incluyendo ratones reporters con la microglia y los neutrófilos de diferentes colores, muestras humanas, o usando diferentes estrategias in vitro e in vivo que afectan a la función fagocítica de la microglia interaccionando con diferentes receptores como son: P2RY12, CSF1R, GAS-6 y CLEC7A. Para estos ensayos se han puesto a punto novedosas técnicas de imagen tanto in vivo e in vitro, ensayos de time-lapse en co-cultivos de microglia de ratón adulto y neutrófilos, y estudios de morfología en 3D a partir de imágenes confocales. Con estas herramientas, esta investigación ha demostrado que la fagocitosis microglial de los neutrófilos y de neuronas apoptoticas supone unas consecuencias fundamentales en el tejido isquémico. Hemos encontrado que la microglía reactiva fagocita neutrófilos infiltrantes en la periferia de la lesión, mientras que en el core isquémico, el hecho de que la microglia se encuentre muerta o distrófica facilita la acumulación de los neutrófilos; primero en los espacios perivasculares y finalmente ya, extravasados al propio parénquima cerebral. Hemos observado también que los receptores P2RY12, CSF1R y GAS-6 están involucrados en el proceso fagocítico de los neutrófilos y que Clec7A es crucial para la fagocitosis de las células neuronales apoptóticas. Finalmente, se han extendido estos resultados a muestras humanas de pacientes que sufrieron un ictus, estudiando su potencial relevancia y añadiendo así, peso a los ya obtenidos en los estudios de in vivo e in vitro. Se ha demostrado que la microglia humana es muy reactiva, fagocitando continuamente neutrófilos. Asimismo, presenta características de proliferación celular además de tener sobreexpresados los diferentes genes estudiados. En conclusión, la investigación desarrollada en esta tesis contribuye a un mayor entendimiento del papel de la microglia después de la isquemia cerebral y de su capacidad fagocítica intrínseca, Los resultados obtenidos permiten avanzar en el desarrollo de nuevas herramientas que ayudarán a abordar el daño inflamatorio causado por el ictus.