Optimización de procesos para la producción industrial de bacteriófagos

Resumen

Las propiedades antimicrobianas de los bacteriófagos los convierten en una alternativa prometedora a los antibióticos y desinfectantes, en aplicaciones como la terapia fágica o el biocontrol y desinfección de alimentos. Tales aplicaciones requieren el desarrollo de estrategias que aseguren su producción a gran escala, la viabilidad de las partículas fágicas durante los procesos de formulación, y su estabilidad durante el almacenamiento y distribución. En este contexto se han establecido los diferentes objetivos de esta Tesis Doctoral. En primer lugar, se han definido las condiciones que maximizan la producción del bacteriófago estafilocócico virulento y polivalente vB_SauM-phiIPLA-RODI mediante la aplicación de la Metodología de la Superficie de Respuesta (MSR) infectando una cepa de grado alimentario, S. xylosus CTC1642. Se estudió el efecto de cuatro variables (concentración bacteriana y fágica inicial, temperatura y agitación), sobre el rendimiento del fago (respuesta), siendo la temperatura y la concentración inicial bacteriana, las variables con una influencia significativa en el proceso. El rendimiento máximo experimental de fago obtenido fue de 9,3 log10 UFP/ml, mientras que el previsto por el modelo en las condiciones optimizadas era de 9,25 ± 0,30 log10 UFP/ml. Este rendimiento es comparable al obtenido con el hospedador original S. aureus IPLA1. Además, se comprobó que el fago phiIPLA-RODI mostraba el mismo rango de hospedador y una capacidad de eliminación de biopelículas muy similar, independientemente de la especie de estafilococo utilizada para su propagación. Por otro lado, se estudió la viabilidad y estabilidad de cuatro fagos pertenecientes a dos familias: Siphoviridae (vB_SauS-phiIPLA35, vB_SauSphi-IPLA88) y Myoviridae (vB_SauM-phiIPLA-RODI y vB_SepM-phiIPLAC1C), bajo cinco condiciones de formulación y almacenamiento: refrigeración, congelación (-20°C, -80°C, -196°C), liofilización, secado por pulverización, con la utilización de varios agentes conservantes (disacáridos, glicerol, sorbitol y leche descremada) y encapsulación con alginato. Se observó que a bajas temperaturas (-80°C y -196°C), todos los lisados de fagos mostraron una buena viabilidad tras 24 meses congelados, independientemente del crioprotector utilizado. En el caso de la liofilización y el secado por pulverización, las principales pérdidas de viabilidad se produjeron durante el proceso de secado, siendo estables durante su almacenamiento tras 12-24 meses a 4ºC. La leche descremada proporcionó una buena protección en la liofilización de los cuatro fagos y en el secado por pulverización de dos fagos (phiIPLA-RODI y phiIPLA88). La trehalosa mostró también buenas propiedades durante el secado por pulverización y permitió el almacenamiento del fago phiIPLA88 a 20°C durante al menos 12 meses. El fago phiIPLA-RODI encapsulado en alginato retuvo una alta viabilidad cuando se almacenó a 4°C durante 6 meses y a 20°C durante 1 mes. Estos resultados sugieren que la encapsulación podría ser una forma adecuada para el transporte de fagos. Otro de los objetivos de esta Tesis Doctoral fue el diseño de formulaciones adecuadas para mejorar la estabilidad del fago phiIPLA-RODI frente a factores como temperatura, pH, y presencia de sales. Para ello, se ensayaron tres tipos de vesículas (niosomas, liposomas y transferosomas), las cuales permitieron una encapsulación exitosa del fago phiIPLA-RODI (eficiencia de encapsulación entre 62%-98%), independientemente de la concentración de los componentes de las vesículas. Además, la infectividad del fago encapsulado se mantuvo durante 6 meses a 4°C para los tres tipos de vesículas, con la excepción de los liposomas que contenían una baja concentración de pronanosome Lipo-NTM (30 mg/ml). A altas concentraciones de sal, el fago no se vio afectado, pero las vesículas se desestabilizaron totalmente. Los niosomas presentaron resultados más interesantes al proteger parcialmente a las partículas de fago frente a pHs bajos y temperaturas elevadas. Por último, se estudió la existencia de interacciones sinérgicas o antagónicas entre el fago phiIPLA-RODI y varios desinfectantes (cloruro de benzalconio, triclosán, clorhexidina y peróxido de hidrógeno) utilizados en entornos clínicos e industriales. Se comprobó la posible interferencia en la eficacia de los mismos para eliminar bacterias patógenas, al utilizar los desinfectantes y el fago de forma combinada. Nuestros resultados sugieren que el cloruro de benzalconio sería el desinfectante más adecuado para usar en ambientes donde se apliquen fagos, ya que la mezcla de ambos antimicrobianos no provoca una disminución de la eficacia de ninguno de ellos.