Función de los canales de potasio y calcio en un modelo de hipertensión

Laburpena

9.1 INTRODUCCIÓN La hipertensión arterial (HTA) es una enfermedad que afecta a cerca del 30 % de la población adulta en los países desarrollados (Chobanian et al., 2003). Además, es un factor de riesgo que aumenta las probabilidades de padecer diferentes patologías cardiovasculares como infarto cardiaco, derrame cerebral e insuficiencia renal. El 95 % de los casos de HTA se diagnostican como hipertensión esencial (HTE), siendo imposible identificar la causa de la elevada presión arterial. Sin embargo, diferentes estudios apoyan la hipótesis de que la HTE se desarrolla como consecuencia de múltiples factores genéticos y ambientales. La HTE se define como el aumento sostenido de las resistencias periféricas totales (RPT) del sistema cardiovascular (SC). El SC esta formado por el corazón y los vasos sanguíneos, que podemos clasificar según el tamaño en: arterias, arteriolas, capilares, vénulas y venas. La actividad contráctil de las células del musculo liso que forman la pared de arterias y arteriolas es el principal determinante de las RPT en la circulación vascular. Los vasos sanguíneos se encuentran normalmente en un estado de contracción parcial denominado tono basal (Nelson & Quayle, 1995), desde el cual pueden contraerse o dilatarse dependiendo de las necesidades de perfusión. El potencial de membrana (EM) de las VSMCs a través de los canales de Ca2+ dependientes de voltage (VDCCs) es el principal factor que regula la [Ca2+]i y por tanto el tono vascular (Knot & Nelson, 1998). Por este motivo, la contracción en musculo liso vascular se encuentra estrechamente acoplada al EM, de forma que una despolarización aumenta la contracción y una hiperpolarización la inhibe (Haeusler, 1983). Como los canales de K+ juegan un papel principal en establecer el EM de las VSMCs, son determinantes en el control del tono vascular y en el diámetro de los vasos. Al menos cuatro tipos de diferentes de canales de potasio han sido identificados en VSMCs: los rectificadores hacia dentro (inward rectifiers K+ channels, KIR), los voltaje dependientes (voltage-dependent K+ channels, Kv), los sensibles a ATP (ATP-gated K+ channels, KATP) y los sensibles a Ca2+ (Ca2+ gated K+ channels, BKCa) (Nelson & Quayle, 1995). Estos cuatro tipos de canales de K+ junto con los VDCCs están implicados directa o indirectamente en la regulación del tono vascular. 9.2 OBJETIVOS El objetivo de esta tesis es determinar los mecanismos iónicos que se encuentran alterados en un modelo murino de hipertensión esencial. Para ello se ha estudiado: el remodelado eléctrico de los canales de K+ (los cuales controlan el EM) y la composición molecular y función de los canales de calcio tipo-L (LTCCs), la principal vía de entrada de Ca2+ al interior celular. 9.3 MATERIALES El modelo de HTE utilizado presenta una hipertension moderada que se desarrolla en el individuo adulto. Estos ratones se han obtenido cruzando ocho cepas distintas de ratones, por lo que comparten un fondo genético similar. Tras múltiples generaciones seleccionando fenotípicamente los ratones en función de su presión arterial se han obtenido dos cepas distintas, una cepa de ratones hipertensos (BPH, blood pressure high) y sus respectivos controles normotensos (BPN, blood pressure normal). Para llevar a cabo los objetivos propuestos se ha recurrido a técnicas electrofisiológicas como el patch-clamp para estudiar las corrientes iónicas a través de los canales de K+ y Ca2+ y el current-clamp para examinar la contribución de los diferentes canales al EM. Se han utilizado las configuraciones de whole-cell (para estudiar corrientes en célula entera), perforated-patch (para examinar las corrientes sin alterar el medio intracelular) y el single channel (para estudiar las propiedades eléctricas de los BKCa). Además, se ha utilizado un miógrafo de presión para caracterizar las funciones fisiológicas y propiedades de los vasos de resistencia de los ratones BPN y BPH. Así mismo, también se ha utilizado la miografía para investigar la contribución de los canales de K+ (KIR y KATP) al tono vascular. Las técnicas moleculares como PCR cuantitativa y el western blot se han utilizado para caracterizar los niveles de expresión de los distintos canales iónicos desde el RNAm hasta las proteínas. La imagen de calcio tanto con el TIRF (fluorescencia de reflexión interna total) como con el swept-field confocal (confocal de barrido) han sido utilizados para examinar la entrada de Ca2+ al interior celular a través de los LTCCs (¿sparklets¿), así como la salida de calcio desde el retículo sarcoplasmatico (SR) a través de los canales acoplados a receptores de rianodina (RyR), ¿sparks¿. 9.4 RESULTADOS 9.4.1 Estudio de los canales de K+ Mediante electrofisiología se comprobó que las células de musculo liso vascular (VSMCs) disociadas de arterias mesentericas de BPH presentaban una menor conductancia a K+ que las de BPN. Esta menor conductancia podría explicar el EM mas despolarizado observado en las VSMCs de BPH. Mediante qPCR se comprobó que había una disminución de los niveles de expresión de los canales KIR (Kir2.1 y Kir4.1) y de los KATP (Kir6.1 y SUR2). Sin embargo esta menor expresión de RNAm, sólo se tradujo en una reducción de las proteínas Kir4.1, SUR2 y mas notablemente en Kir6.1. La expresión funcional de estos canales se evaluó utilizando la técnica de whole-cell y de parche perforado. De esta forma, se confirmó midiendo densidad de corriente, que tanto los canales KIR como los KATP estaban disminuidos en BPH, siendo estos últimos los que lo hacían de forma más significativa. Mediante estudios de current-clamp se evidenció la menor contribución de los canales KATP al establecimiento del EM en los miocitos de ratones BPH. Por ultimo, se analizó la contribución de ambos canales al tono vascular y por tanto al fenotipo hypertensivo mediante miografía. En estos experimentos los canales KIR no mostraron diferencias significativas entre BPN y BPH, sin embargo la contribución de los canales KATP al tono vascular se encontraba significativamente reducida en las arterias de BPH. 9.4.2 Estudio de los canales de Ca2+ La caracterización funcional de las corrientes de Ca2+ se evaluó mediante técnicas electrofisiológicas en VSMCs de ratones BPN y BPH. Primero se comprobó que la corriente de Ca2+ en estas células se debía principalmente a canales de calcio tipo-L, ya que la mayor parte de la corriente se bloquea con nifedipina (bloqueante de los canales tipo-L) y porque las propiedades fisiológicas y cinéticas de las corrientes son características de los LTCCs. La densidad de corriente a través de los LTCCs tanto en whole-cell como en parche-perforado se encontraba significativamente disminuida en las células BPH, con lo que se descarto la presencia de un inhibidor intracelular de la corriente en los miocitos de ratones BPH. El uso del BayK-8644 (agonista de los LTCCs) produjo un aumento significativo de ambas corrientes, sin embargo el efecto potenciador del BayK fue mayor en BPH. Esto sugiere que las células BPH tienen tanto una menor población de LTCCs como una composición de subunidades diferentes. Los análisis de RT-PCR revelaron un descenso en los niveles de expresión de RNAm en las subunidades ¿1C y ß2 y un aumento significativo en los de la subunidad ¿2¿. Esta diferencia en la composición de las subunidades podría explicar las diferencias funcionales observadas en las corrientes. Utilizamos la gabapentina (GBP), un ligando de la subunidad ¿2¿, para explorar la contribución de esta subunidad a las corrientes mediadas por los LTCCs. El efecto de esta droga produjo un mayor incremento de la corriente en BPH que en BPN, sugiriendo que en BPH esta subunidad se encuentra más disponible para formar un LTCCs funcional. Para una mejor caracterización del efecto de la GBP se recurrió a curvas dosis respuesta en células nativas y en HEKs trasnfectadas con las diferentes subunidades. Los efectos de la GBP sobre las corrientes de los LTCCs mostraron ciertas similitudes entre los BPN y las HEKs co-trasnfectadas con ¿1+¿2¿ y entre los BPH y las HEKs co-transfectadas con ¿1+¿2¿+ß2. Estos resultados confirmaron que la presencia de ¿2¿ es necesaria para la unión de la GBP y que las diferencias entre BPN y BPH podrían deberse a la diferente proporción de las subunidades ß. La organización y función de los LTCCs se estudió mediante la observación de la entrada de Ca2+ utilizando la técnica del TIRF. Los resultados obtenidos permitieron comprobar que en condiciones fisiológicas los LTCCs de las células BPH funcionan con mayor probabilidad de apertura, están en estado abierto durante más tiempo, y se organizan en grupos mayores que los de BPN. 9.4.3 Acoplamiento spark-STOCs El acoplamiento entre la salida de Ca2+ del SR a través de los RyR ¿spark¿ y las corrientes espontaneas y transitorias a través de los BKCa ¿STOCs¿ es un mecanismo de freno a la contracción ya que supone la hiperpolarización de la VSMCs. En las células BPH la amplitud de los sparks de Ca2+ está significativamente aumentada comparada con la de BPN, sin embargo esto no supone un aumento de las STOCs en estas células. Al medir mediante parche perforado STOCs en BPH, vimos una pronunciada disminución tanto de la frecuencia como de la amplitud de estas señales. Estos datos podían explicarse por la reducción de la subunidad ß1 de los canales BKCa, que regula su sensibilidad a Ca2+. Mediante registros de single-channel se comprobó que el número se canales y su sensibilidad a calcio estaban disminuidos en las células de los ratones BPH. 9.5 DISCUSION En la mayoría de los casos de HTE las causas de la elevada presión arterial se atribuyen a un origen multifactorial, tanto a factores genéticos como ambientales. Nuestro modelo de hipertensión obtenido por selección fenotípica mediante diversos cruces es un claro ejemplo de cómo múltiples y sutiles cambios pueden contribuir a la génensis de un fenotipo hipertensivo. Así, la elevada respuesta miogénica presente en las arterias de los ratones BPH podría ser una consecuencia de múltiples factores: 1. El potencial de membrana de reposo despolarizado en las células BPH (¿10 mV). 2. La disminución de la contribución funcional de los canales KIR y KATP en las VSMCs de BPH, aunque hemos comprobado que solo los KATP afectan al tono vascular en BPH. 3. La menor población o la diferente composición de los LTCCs en la membrana de las miocitos en BPH. 4. La mayor actividad de los LTCCs debido a la mayor probabilidad de apertura, un estado abierto mas prolongado y a su organización en grupos mas grandes. 5. El desacoplamiento que se produce entre sparks y STOCs reduciendo el freno a la contracción. En resumen, nuestros datos apoyan la hipótesis de que cambios en la expresión funcional de los canales KIR, KATP, BKCa y LTCCs son importantes en el desarrollo de la HTE, ya que podrían ser determinantes principales en la despolarización del EM y en el incremento de la entrada de Ca2+ en las VSMCs de ratones hipertensos.