Regulacion de la expresion de la subunidad glun1 del receptor de glutamato tipo nmda en excitotoxicidad e isquemia cerebral

Resumen

Los receptores de glutamato tipo N¿metil¿D¿aspartato (NMDARs) son canales iónicos heteroméricos de gran importancia en el funcionamiento normal y patológico del SNC, en los que GluN1 es una subunidad obligatoria. Su estimulación en exceso da lugar a la muerte neuronal por excitotoxicidad que tiene un papel central en accidentes cerebrovasculares y también está asociada a otros daños agudos y crónicos del SN, como los que ocurren en enfermedades neurodegenerativas. Trabajos previos del grupo demostraron la represión de la transcripción del gen glun1 en condiciones de excitotoxicidad e isquemia cerebral. En esta tesis hemos utilizado modelos in vitro de excitotoxicidad y de isquemia cerebral para caracterizar en detalle los mecanismos de dicha regulación. Para ello, nos hemos apoyado en estudios in silico, generación y análisis de mutantes del promotor génico, sobre¿expresión o interferencia génica de diversas proteínas reguladoras, experimentos de inmunoprecipitación de proteínas o cromatina (ChIP) y uso de inhibidores químicos. Hemos demostrado que la regulación de glun1 está mediada fundamentalmente por dos elementos de respuesta MEF2 (¿812/¿789 y ¿2363/¿2341) y dos CREs (¿ 343/¿324 y ¿315/¿296) de su promotor proximal, necesarios para su activación por concentraciones sub¿tóxicas de agonista y su represión en condiciones de excitotoxicidad. La quinasa ERK5, activada por la vía BDNF/TrkB, tiene un papel central en la regulación basal de GluN1, principalmente a través de los elementos MEF2 anteriores. Sin embargo, en excitotoxicidad, pERK5 es inactivada por un mecanismo dependiente de la proteína¿fosfatasa PP1 que participa en la inhibición de la transcripción de glun1 probablemente por una disminución de la actividad de los factores de transcripción (FTs) MEF2 y CREB a la que también contribuirían su defosforilación por PP1 y la actividad de HDACs de clase III (sirtuínas). En fases más avanzadas del proceso de excitotoxicidad, la proteasa calpaína también participa en la represión de glun1 mediante el procesamiento de MEF2A, MEF2D y CREB. Adicionalmente, el represor REST, con la participación obligada de HDAC1, inhibe la actividad del promotor glun1 a través de los elementos CRE y MEF2 anteriores y RE1 (¿150/¿131), tanto en excitotoxicidad como de forma más atenuada en condiciones basales. Es relevante el aumento en los niveles de HDAC1 observado desde tiempos muy tempranos tras la inducción de excitotoxicidad in vitro o in vivo. Resultados preliminares sugieren la formación de un complejo DNA/proteína, que incluiría a los FTs pCREB y MEF2 asociados entre si reconociendo los elementos MEF2 y CRE del promotor de glun1. En excitotoxicidad, estos complejos estarían favorecidos e incorporarían la proteína HDAC1, que junto con REST inhibiría la transcripción de glun1. Los resultados anteriores, a través de la caracterización de la regulación del gen glun1, muestran como afecta la excitotoxicidad a la función de FTs clave para la expresión de genes implicados en la supervivencia neuronal que podrán ser investigados como posibles dianas de neuroprotección frente al daño isquémico.