Aplicación de los residuos cítricos como fuente de biocidas naturales. Obtención de extractos bioactivos

Resumen

A nivel mundial se generan anualmente millones de toneladas de subproductos derivados del procesado y manufacturado de cítricos en la industria alimentaria. Solo una pequeña parte es empleada para la obtención de nuevos productos considerándose el resto como un residuo, con el consiguiente impacto negativo en el medio ambiente. Además estos subproductos de cítricos son muy inestables debido principalmente a la oxidación y al deterioro microbiológico. Por este motivo, esta memoria de tesis doctoral se ha centrado en el aprovechamiento de los residuos cítricos analizando su composición y sus propiedades biocidas, realizando un aislamiento biodirigido para la obtención de compuestos activos y un posterior estudio de interacciones entre ellos. El estudio comparativo a nivel laboratorio, en base a criterios de rendimientos según el método de extracción, bioactividad general, screening insecticida y fungicida, de los extractos de los residuos de la especie de cítricos Citrus sinensis cv Valencia Late y Citrus sinensis cv Navelina, permitió seleccionar los métodos de arrastre de vapor (AV) y maceración (en DCM y Acetona) como idóneos para obtener a escala semi-industrial cinco extractos a partir de residuos de Citrus sinensis cv. Valencia Late (VL) y Citrus aurantium o naranja amarga (NA): VL/AV, VL/DCM, VL/Acetona, NA/DCM y NA/Acetona, para su posterior estudio en actividad fungicida, insecticida y aislamiento biodirigido, realizando una selección de fracciones activas a través del bioensayo de coleóptilos de trigo. El aislamiento y elucidación estructural de los compuestos mayoritarios presentes en las fracciones activas de los residuos seleccionados, dio como resultado 34 compuestos conocidos: 14 flavonoides, 5 cumarinas, 2 limonoides, 3 ácidos grasos y derivados, 3 fenilpropanoides, 2 esteroides, 3 terpenos, un derivado del glicerol, y un compuesto no natural, que se agrega a la corteza de cítricos como agente protector durante el procesado industrial (ácido maleopimárico). Así mismo, se han identificado 15 compuestos conocidos por espectroscopía de masas del extracto de aceite esencial obtenido por arrastre de vapor de Citrus sinensis cv Valencia Late (VL/AV) (6 monoterpenos, 8 sesquiterpenos y un aldehído). En el bioensayo de coleóptilos etiolados de trigo de los compuestos mayoritarios purificados dieron actividad agrupando en un primer grupo más activo: dos fenilpropanoides (p-propenilanisol y el trans-pseudoisogenol-2-metilbutirato), una cumarina (isomeranzina), dos derivados de ácidos grasos (ácido b-dimorfecólico, y ácido 9-oxo-(19E,12Z)-octadecadienoico) y el compuesto no natural (ácido maleopimárico), con valores de inhibición alrededor de 90%, que fue similar al valor obtenido por el herbicida comercial de referencia, y mejores resultados que sus fracciones y extractos iniciales. En un segundo grupo se engloban los compuestos mayoritarios de estos extractos, que resultaron ser 7 polimetoxiflavonas (tetra-O-metilescutellareina, 6,7,8,3',4'-pentametoxiflavona, 3,5,6,7,3',4'-hexametoxiflavona, nobiletina, sinensetina, tangeretina, y 3,5,6,7,8,3',4'-heptametoxiflvonna). Estas obtuvieron actividades muy significativas (superando el 60% de inhibición), resaltando la inhibición de la 3,5,6,7,3',4'-hexametoxiflavona (90%). Por otra parte, dado que diversas actividades biológicas de los zumos y extractos de cítricos han sido relacionadas con su actividad antioxidante. Se procedió a un análisis de la capacidad de captación de radical libre mediante el método DPPH, de los extractos y fracciones más activas, así como de los compuestos mayoritarios aislados. Los resultados mostraron con mayor capacidad antioxidante a las fracciones del extracto de acetona que alcanza hasta un 80% de actividad antiradicalaria, siendo consideradas con una actividad antioxidante fuerte por el índice de actividad antioxidante (AAI). Este resultado contrastaba con los obtenidos para los extractos y los compuestos ensayados (9 flavonas, 1 cumarina, 1 fenilpropanoide y 1 ácido graso) que no superaron el 35% y el 10% de actividad antiradicalaria respectivamente. Para explicar los valores de bioactividades obtenidos en los extractos y fracciones, se probaron en el bioensayo de coleóptilos combinaciones binarias entre compuestos con el fin de obtener un análisis más profundo de los efectos de interacción en esas mezclas. Las pruebas de las mezclas binarias se realizaron entre los compuestos aislados mayoritarios más activos, y entre un compuesto activo y fracciones activas. Los resultados obtenidos en el estudio de las interacciones, tanto con las mezclas binarias de productos, como con mezclas complejas (un total de 65 combinaciones), mostraron en su mayoría efectos aditivos (50 combinaciones, 76,9%), seguido por los efectos sinérgicos (9 combinaciones, 13,8%) y, en menor medida, antagónicos (6 combinaciones, 9,2%). Por lo tanto, de todas las posibles interacciones, los efectos aditivos y sinérgicos fueron más numerosos que los antagónicos. Estos resultados son consistentes con resultados reportados en la literatura, con respecto a considerar un enfoque holístico para explicar las actividades de extractos y fracciones de cítricos, que son posiblemente debido a la prevalencia de más efectos aditivos y sinérgicos que de efectos antagonistas. El estudio que aquí se presenta pone de relieve la importancia de la reproducibilidad de un sistema de prueba de ensayo de actividad, como es el bioensayo generalista de coleóptilos etiolados de trigo, como herramienta adecuada en la exploración, no sólo de posibles bioactividades de extractos, fracciones y productos, sino también de bioactividades de las mezclas binarias y complejas, para evaluar las posibles interacciones químicas entre compuestos. Este ensayo sirve como sistema de prueba en una primera proyección, ya que es un bioensayo rápido y eficiente, para que posteriormente esas mezclas binarias con interacción pasen a ser probadas en otros bioensayos más específicos, y que en principio resultan más laboriosos y costosos. Se necesitan más estudios para determinar la eficacia de nuestro estudio y demostrar la utilidad de estos bioensayos en su potencial efecto sobre muchas otras interacciones en mezclas binarias y complejas.