Biofuncionalización de nanoestructuras para aplicación en sistemas de detección

Resumen

La presente tesis doctoral, enmarcada en el campo de nanobiotecnología, presenta el desarrollo de diversas estrategias de biofuncionalización de nanoestructuras con diferentes propiedades con el fin de ser aplicadas en sistemas de detección tipo inmunoensayos e inmunosensores. Este trabajo se aborda desde dos perspectivas: biofuncionalización de (i) nanopartículas y (ii) superficies nanoestructuradas. La primera parte se centra en la evaluación de diversos factores en las características y funcionalidad de conjugados de nanopartículas de oro (AuNPs) y carbono (CNPs) con enzimas y/o anticuerpos. Se comparan las estrategias de unión covalente y adsorción mediante la conjugación de la enzima hierro superóxido dismutasa (FeSOD) a AuNPs a través de un brazo de unión. Se observa que la unión covalente resulta algo más favorable en cuanto a cobertura y actividad enzimática, además de mayor estabilidad frente a variaciones de fuerza iónica y pH del medio, si bien la reproducibilidad de ambas estrategias es algo reducida. Asimismo, se muestra que es posible manipular la disposición de las enzimas secuenciales glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa (HRP) sobre CNPs mediante la modificación del orden de incubación y las proporciones proteína:CNP, lo que afecta a la actividad del complejo. Se comprueba que la GOx presenta mayor afinidad por las CNPs, si bien su actividad se ve afectada, al contrario que la HRP, cuya eficiencia catalítica aumenta tras la unión a CNPs. Por otra parte, se comparan diferentes metodologías de biofuncionalización de AuNPs con anticuerpos y la enzima HRP, adsorción directa, covalente o covalente orientada, con el fin de comparar su potencial para mejorar la sensibilidad del inmunoensayo ELISA. La unión por adsorción proporciona una mayor capacidad de amplificación, consiguiendo un aumento en la sensibilidad en la detección del alérgeno gliadina de seis veces mediante ELISA indirecto. La segunda parte presenta la caracterización de un novedoso biosensor óptico basado en nanoestructuras periódicas de pilares resonantes (RNP) formados por multicapas de SiO2/Si3N4. Se describe el desarrollo del proceso de biofuncionalización de estos materiales dispuestos en nanopilares, aplicando diferentes estrategias de activación, silanización y unión covalente de biomoléculas, llegando a un protocolo de biofuncionalización estable y reproducible. Asimismo, se desarrolla un protocolo para la detección de la interacción antígeno-anticuerpo empleando el modelo IgG-anti-IgG y un formato directo, demostrando la capacidad de los RNP como sensores a tiempo real (real time) y en ausencia de marcadores (label-free). Además, es posible regenerar esta interacción, permitiendo la re-utilización de la superficie. Este procedimiento es empleado para el desarrollo de métodos de medida para la detección de analitos de bajo peso molecular (ácido ocadaico y bifenilo policlorado 169) en el rango de ng/ml aplicando un formato competitivo.