Biogeographic patterns of marine bacterioplankton in epipelagic waters

  1. hernando morales, V'ictor
Supervised by:
  1. Eva Teira González Director

Defence university: Universidade de Vigo

Fecha de defensa: 05 February 2016

Committee:
  1. Josep M. Gasol Chair
  2. Gerhard J. Herndl Secretary
  3. Laura Alonso Sáez Committee member

Type: Thesis

Teseo: 396449 DIALNET

Abstract

Capítulo 1. Introducción. Los microorganismos, que incluyen una variedad de formas de vida pertenecientes a los dominios Bacteria, Archaea y Eukarya, así como los virus, aunque invisibles a simple vista, son seres ubicuos que se encuentran en los todos ecosistemas de la Tierra. La ecología microbiana es el estudio de la diversidad y distribución de estos microorganismos, su relación entre sí y con su entorno. Desde la invención del microscopio en el siglo XVII (Antoni van Leeuwenhoek) hasta los estudios de microbiología actuales, se han ido incorporando numerosas técnicas para el estudio de los microorganismos en diversos ambientes que han permitido grandes avances en este campo. Sin embargo, el comienzo de lo que se conoce como ecología microbiana marina moderna no tiene lugar hasta finales de los años 70, , cuando gracias al desarrollo de técnicas adecuadas para su detección (microscopia de epifluorescencia) se supo de la gran abundancia e importancia de estos organismos en el medio marino (Zimmerman and Meyer-Reil, 1974; Hobbie et al, 1977; Pomeroy, 1974). Durante los últimos 40 años, la biología molecular ha revolucionado el campo de la ecología microbiana, llenando algunas de las lagunas importantes relacionadas con la historia natural de estos organismos. Descubrimientos notables han demostrado que los océanos albergan una gran cantidad de microorganismos (Hobbie et al, 1977; Sogin et al, 2006), representando una enorme diversidad genética (Sogin et al, 2006; Woese et al, 1985; Venter et al, 2004; Giovannoni & Stingl, 2005) y una enorme versatilidad metabólica y fisiológica, lo cual les confiere un papel esencial en prácticamente todos ciclos biogeoquímicos del planeta (Pomeroy, 1974; Cotner y Bidanda, 2002; Falkoswi et al, 2008). La diversidad de las bacterias marinas supera, con mucho, la de los organismos eucariotas. Un mililitro de agua de mar del océano superficial puede albergar aproximadamente entre 105 a 106 bacterias de posiblemente miles de especies diferentes. Los microorganismos fotosintéticos, incluyendo tanto procariotas y eucariotas, realizan la mayor parte de la producción primaria en el océano. Estos organismos utilizan la energía solar para transformar carbono inorgánico (CO2) y agua (H2O) en oxígeno (O2) y carbono orgánico (moléculas de carbohidratos). Aproximadamente la mitad de la producción primaria en la Tierra se produce en las primeras decenas de metros de los océanos (~ 52.5 petagramos de carbono por año) (Field, 1998). El bacterioplancton controla los flujos de nutrientes en el sistema a través de la mineralización de la materia orgánica. Una fracción importante de esta producción primaria oceánica fluye a través del compartimento de la materia orgánica (MOD). Las bacterias heterótrofas son capaces de utilizar esta materia orgánica disuelta (MOD) que deriva de los organismos autótrofos y de la actividad metabólica de otros organismos heterótrofos de mayores dimensiones presentes en el ambiente pelágico (Pomeroy, 1974; Azam et al, 1983; Ducklow y Carlson, 1992; Nagata y Kirchman, 1999; Azam y Malfatti, 2007). Una fracción de la MOD incorporada por bacterias heterótrofas es devuelta al océano en forma de nutrientes inorgánicos y CO2 a través de la respiración. Sin embargo, otra fracción se transfiere a escalones superiores de la cadena trófica. Esta importante vía de flujo de carbono mediada por bacterias se conoce como el "bucle microbiano" (Pomeroy, 1974; Azam & Malfatti, 2007). Los microorganismos marinos también juegan un papel fundamental en los ciclos biogeoquímicos de otros elementos tales como el nitrógeno (N), fósforo (P) o por ejemplo el azufre (S). Como consecuencia, su metabolismo mantiene los principales ciclos biogeoquímicos de la Tierra, y por lo tanto el estudio de su diversidad y ecología es fundamental para una adecuada comprensión de la función de los ecosistemas. Durante muchos años, las comunidades microbianas se han descrito mediante técnicas tradicionales de cultivo en el laboratorio. Hoy en día sabemos que no es posible el aislamiento y crecimiento en cultivo puro de la mayor parte de los procariotas presentes en el medio marino (Rappe y Giovannoni, 2003) y por esta razón el estudio de la diversidad microbiana en ambientes naturales en general, y marinos en particular, se basa en la aplicación de técnicas moleculares independientes del cultivo. La descripción molecular de comunidades bacterioplanctónicas se basa, pues, en la extracción directa de ADN. Los métodos más utilizados se basan en la amplificación, clonación y secuenciación del gen codificador del ARN ribosómico (16S en procariotas y 18S en eucariotas). Se trata de un gen universal, presente en todos los organismos. Existen también herramientas tales como las técnicas de huella genética, como por ejemplo la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE por sus siglas en inglés Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Muyzer et al., 1993), análisis del polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción terminales (T-RFLP por sus siglas en inglés Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism) (Thies 2007), o el análisis automático del espaciador intergénico ribosomal (ARISA por sus siglas en inglés Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), que permiten obtener información de la estructura de la comunidad microbiana en un gran número de muestras. Estas técnicas pueden complementarse con la identificación filogenética de las unidades taxonómicas operacionales (OTUs, por sus siglas en inglés, operational taxonomic units). Por último existen técnicas moleculares que no requieren la extracción y amplificación del ADN, que utilizan sondas específicas marcadas con fluorocromos y que permiten la detección de microorganismos por microscopía de epifluorescencia, como la hibridización fluorescente in situ (FISH por sus siglas en inglés Fluorescent in situ hybridization) (Amann et al., 1990) o CARD-FISH (por sus siglas en inglés Catalized Reported Deposition-FISH) (Pernthaler et al, 2002). La biogeografía microbiana se encarga de estudiar la distribución de las especies de microorganismos en el espacio y el tiempo (Lomolino et al, 2006). En otras palabras, la biogeografía microbiana intenta responder a una simple pregunta: ¿Por qué viven los microorganismos donde lo hacen? Para responder a ello, se requiere de la cuantificación de la diversidad microbiana combinada con información adicional, más allá de la que se puede derivar de la diversidad filogenética, tal como el estudio de las condiciones ambientales, procesos históricos del ambiente, etc. Esta información nos puede ayudar a dilucidar los procesos que influyen en la biogeografía marina microbiana. A pesar de que la biogeografía microbiana se encuentra aún en sus inicios, hoy en día sabemos que las comunidades microbianas muestran variación una lo largo de un amplio rango de escalas espaciales y temporales y, por tanto, muchos taxones microbianos presentan de hecho patrones biogeográficos (Martiny et al, 2006, Fuhrman et al, 2015). Uno de los debates más activos, promovido por Martiny y colaboradores (2006), se centra en determinar la importancia relativa de los ¿procesos locales¿ (relacionados con la heterogeneidad ambiental que favorece la selección) y los ¿procesos históricos¿ (debidos a la existencia de barreras geográficas que impiden la dispersión) en la conformación de la biogeografía microbiana. La capacidad de detectar unos procesos y otros depende del grupo taxonómico en cuestión, de la resolución taxonómica del estudio, de las escalas espaciales y temporales abordadas, y de las características de los diferentes ambientes estudiados (Fierer, 2008; Hanson et al 2012; Nemergut et al. 2013). Por tanto, tanto las escalas espaciales como las temporales son importantes a la hora de abordar el estudio de la distribución de los microorganismos. A pesar de que las bacterias regulan los principales ciclos biogeoquímicos del planeta, todavía no está claro hasta qué punto la diversidad bacteriana afecta al mantenimiento de dichas funciones del ecosistema. Existen algunos estudios que demuestran una relación significativa entre los cambios en la composición de la comunidad bacteriana y los flujos de carbono mediados por ésta (Alonso-Sáez et al, 2007; Teira et al, 2008), mientras que otros no encuentran ninguna conexión entre estructura y función de la comunidad bacteriana (Langenheder et al, 2006;) Es posible que nuestra capacidad de detectar dicha conexión dependa de las escalas espaciales y temporales del estudio, así como de las características del ambiente (Comte y Del Giorgio, 2010). Objetivos y esquema de la tesis El objetivo general de esta tesis es estudiar los patrones biogeográficos del bacterioplancton marino que habita la zona eufótica a lo largo de diferentes escalas espaciales, incluyendo las escalas horizontal y vertical, y temporales (durante un ciclo anual) para comprender mejor los procesos que gobiernan las comunidades bacterioplanctónicas marinas en aguas epipelágicas. Los objetivos específicos de esta tesis fueron: (1) Describir la variabilidad espacial y temporal de la estructura de la comunidad bacteriana marina en aguas epipelágicas. (2) Describir la variabilidad espacial y temporal de poblaciones bacterianas individuales en aguas epipelágicas. (3) Evaluar el efecto de la dispersión en la estructura de la comunidad bacteriana. (4) Evaluar el efecto de los factores ambientales sobre la estructura de la comunidad bacteriana y sobre la dinámica de poblaciones bacterianas. (5) Relacionar la variabilidad ambiental, la estructura de la comunidad bacteriana y los flujos de carbono mediados por las bacterianas. Con el fin de alcanzar los objetivos 1 y 2 muestreamos en aguas epipelágicas del Paso del Drake y alrededor de las Islas Shetland del Sur (SSI) en el Océano Austral en enero de 2010 y en dos estaciones costeras de Galicia (noroeste de España) durante un ciclo anual (de enero a diciembre de 2010). Aplicamos una variedad de herramientas moleculares para estudiar la estructura de la comunidad bacteriana y su diversidad, incluyendo CARD-FISH (Capítulo 3), la técnica de huella genética ARISA (Capítulo 3, 4 y 5) y clonación y secuenciación (Capítulo 5). Con el fin de estudiar la dinámica de poblaciones bacterianas individuales combinamos la técnica de huella genética ARISA con la construcción de genotecas del gen de ARN ribosómico (ARNr) 16S y la región del espaciador intergénico (ITS, de las siglas en inglés intergenic spacer) (Capítulo 5). Para superar las dificultades intrínsecas de evaluar el efecto de la dispersión (objetivo 3) en las comunidades bacterianas marinas y para compensar la fuerte influencia que ejerce el medio ambiente sobre la selección de organismos, se estudió la estructura de la comunidad bacteriana de diferentes masas de agua con características ambientales similares en torno a las SSI y en el paso del Drake en el Océano Austral. Se utilizó un modelo multiparamétrico óptimo extendido para estimar matemáticamente las contribuciones de las masas de agua y calcular un índice de mezcla de masas de agua como estima de la probabilidad de dispersión, en lugar de utilizar las distancias geográficas (Capítulo 3). Para relacionar la estructura de la comunidad bacteriana y la dinámica de poblaciones bacterianas con el amplio conjunto de variables ambientales se utilizaron métodos de análisis multivariante y de correlación (Capítulos 3, 4 y 5) (objetivo 4). Para lograr el objetivo 5 se utilizó una modificación del test de Mantel para calcular los coeficientes de correlación parcial entre matrices de distancia o similitud con el fin de controlar los posibles efectos espurios. La organización de este proyecto de tesis, realizada en base a estos objetivos específicos, incluye: Capítulo 1: Breve introducción que resume la importancia, técnicas de estudio, patrones biogeográficos e implicaciones funcionales de las bacterias en el medio marino y presenta los objetivos de la tesis. Capítulo 2: Descripción detallada de las técnicas de muestreo y análisis empleadas. Capítulo 3: Estudio centrado en describir la variabilidad espacial de la estructura de la comunidades bacteriana y en determinar la influencia relativa de las condiciones ambientales y la dispersión. Capítulo 4: Estudio de la dinámica espacial y temporal de la estructura de la comunidad bacteriana y su relación con las condiciones ambientales y el flujo de carbono mediado por las bacterias. Capítulo 5: Estudio de la dinámica espacial y temporal de poblaciones bacterianas individuales en relación con las condiciones ambientales. Finalmente se exponen las principales conclusiones derivadas de esta investigación. Capítulo 2: Metodología En este capítulo se detalla la estrategia de investigación aplicada para estudiar cómo varían las comunidades del bacterioplancton marino tanto en el espacio(escala horizontal y vertical) como en el tiempo (durante un ciclo anual) para entender los procesos que estructuran las comunidades de bacterioplancton marino en aguas epipelágicas. Prestamos especial interés al efecto de la mezcla de masas de agua y los eventos de afloramiento y hundimiento a lo largo del ciclo estacional. La estrategia de muestreo abarcó, por un lado un estudio oceanográfico alrededor de las Islas Shetland del Sur y del Paso del Drake, un área altamente hidrodinámica del Océano Austral, durante el verano austral de 2010, donde convergen una mezcla de masas de agua; y por otro lado, un estudio temporal a lo largo de un año t llevado a cabo en dos estaciones situadas sobre la plataforma de las costas de Galicia (NO de la Península Ibérica). Se utilizaron una gran variedad de metodologías estándar para la caracterización de las condiciones ambientales, incluyendo variables físicas, químicas y biológicas. Para caracterizar las comunidades bacterianas se utilizaron una variedad de herramientas moleculares con distinta resolución taxonómica incluyendo: (1) CARD-FISH con varias sondas específicas para la detección de grupos bacterianos a nivel desde filo hasta género; (2) la técnica de análisis de huella genética ARISA, que explota la variabilidad en longitud del espaciador intergénico del ribosoma (ITS), y tiene resolución a un nivel próximo al de especie; y (3) la construcción de bibliotecas y secuenciación de parte del gen ARNr 16S y de la región ITS, que permitió la de las OTUs detectadas mediante la técnica ARISA. Capítulo 3: La mezcla de masas de agua controla la biogeografía bacteriana en una región altamente hidrodinámica del Océano Austral A pesar de que existen evidencias convincentes que indican que los microbios marinos muestran patrones biogeográficos, se sabe muy poco sobre los mecanismos que determinan estos patrones en los ecosistemas acuáticos. En este capítulo examinamos la estructura de la comunidad bacteriana de 133 muestras de aguas epipelágicas recogidas alrededor de las Islas Shetland del Sur y en el Paso del Drake, donde se produce la mezcla de varias masas de agua. En base a las características físico-químicas de las muestras realizamos una caracterización de las distintas masas de agua para determinar la influencia de los factores ambientales y la mezcla de masas de agua (como indicador de la dispersión) sobre la biogeografía bacteriana. La estructura de la comunidad bacteriana se analizó a una baja resolución taxonómica (grandes grupos filogenéticos evaluadas por hibridación in situ fluorescente) y a una resolución taxonómica relativamente alta (unidades taxonómicas operacionales (OTUs, de sus siglas en ingles) mediante la técnica de huella genética ARISA. Se observó que las comunidades bacterianas eran específicas de cada masa de agua. Por otra parte se encontró que los factores ambientales explicaban mejor la estructura de la comunidad observada a baja resolución taxonómica, mientras que la dispersión explicaba mejor los cambios en la estructura de la comunidad en base a las OTUs del ARISA.. Aunque las masas de agua pueden actuar como barreras físicas que separan hábitats distintos, nuestros resultados apoyan la idea de que las corrientes y la mezcla de agua pueden tener un efecto considerable en la conexión y la transformación de los diferentes cuerpos de agua, y por lo tanto, en la mezcla y modificación de comunidades de microorganismos. Teniendo en cuenta el carácter multidimensional y dinámico de nuestros océanos, consideramos que el análisis de la mezcla de masa de agua es un enfoque más adecuado para investigar el papel de la dispersión en la biogeografía del plancton microbiano que el simple uso de distancias geográficas. Capítulo 4: Dinámica de la comunidad bacteriana en un sistema de afloramiento costero. El análisis de los patrones estacionales de las comunidades bacterianas planctónicas a lo largo de diferentes escalas espaciales puede contribuir a mejorar nuestra capacidad de predecir las respuestas a largo plazo del plancton en relación con el cambio climático. Varios trabajos han demostrado que las comunidades bacterianas siguen patrones recurrentes predecibles en un amplio rango de escalas temporales; sin embargo, existen pocos estudios que hayan evaluado simultáneamente la variabilidad temporal y espacial (horizontal y vertical). En este capítulo, analizamos simultáneamente la estructura de la comunidad bacteriana a lo largo de un ciclo anual en dos profundidades (superficie y base de la capa eufótica), en dos estaciones costeras localizadas en la plataforma de las Rías Altas (en frente de A Coruña) y de las Rías Baixas (en frente de la Ría de Vigo). Para ello, evaluamos la estructura de la comunidad bacteriana mediante análisis de huella genética con ARISA. Los resultados obtenidos demuestran que la estructura de la comunidad bacteriana sigue un patrón estacional en ambas estaciones y profundidades, siendo éste más evidente en las aguas superficiales que en la base de la zona eufótica. En términos generales, la estructura de la comunidad mostró una distribución homogénea en la escala horizontal y heterogénea en la vertical. Durante el periodo de hundimiento, la comunidad bacteriana presentó una mayor diversidad que durante el periodo de afloramiento, y mostró una mayor similitud en ambas escalas espaciales, probablemente debido al proceso de mezcla invernal. Estos hallazgos son consistentes con estudios previos realizados en otras regiones templadas, y sugiere una marcada influencia de los factores regionales estacionales, como la dinámica de afloramiento-hundimiento, en la comunidad bacteriana que habita estas aguas costeras. Además, nuestros resultados sugieren que en estas regiones productivas los flujos de carbono mediados por las bacterias parecen estar controlados principalmente por la estructura de la comunidad en las aguas superficiales así como por los factores ambientales locales en la base de la zona eufótica. Capítulo 5: Dinámica de las poblaciones bacterianas en un sistema de afloramiento costero. El seguimiento conjunto a lo largo de series temporales de variables ambientales y de la estructura de la comunidad bacteriana mediante métodos de huella genética han resultado ser una poderosa herramienta para el estudio de estos microorganismos. Esta aproximación junto con la identificación taxonómica de los grupos de microorganismos proporciona información clave relacionada con la dinámica poblacional, y ha permitido detectar tanto variaciones estacionales y de corta escala de las comunidades, como la estabilidad de las mismas a largo plazo. Sin embargo, los factores que controlan la dinámica de taxones bacterianos específicos y sus implicaciones en el funcionamiento del ecosistema siguen siendo aspectos poco conocidos. En este capítulo analizamos la longitud de la región ITS de más de 500 clones, con el fin de identificar filogenéticamente las poblaciones bacterianas detectadas mediante ARISA a lo largo de un ciclo anual. Nuestros resultados muestran una amplia variedad de grupos de poblaciones de bacterias que tienden a coexistir y responder de forma similar a factores regionales y locales, sugiriendo que desempeñan funciones análogas o complementarias. En términos generales, la mayoría de estos grupos bacterianos incluyen poblaciones que pertenecen a distintos grupos filogenéticos, lo que parece indicar que haya poblaciones alejadas filogenéticamente que son capaces de adaptarse a nichos similares. Conclusiones 1. Las comunidades bacterianas que habitan en la zona eufótica mostraron patrones biogeográficos claros tanto espaciales como temporales. 2. Teniendo en cuenta el carácter multidimensional y extraordinariamente dinámico de los océanos, el análisis de la mezcla de masa de agua resultó ser un enfoque más adecuado para investigar el papel de la dispersión en la biogeografía bacterioplancton que la distancia espacial. 3. Se observó que distintas comunidades de bacterias habitaban en diferentes masas de agua alrededor de las Islas Shetland del Sur, donde tanto las condiciones ambientales locales como la dispersión determinan la biogeografía bacteriana. 4. Los efectos ambientales sobre las comunidades bacterianas pueden verse enmascarados si se evalúan dichas comunidades con una alta resolución taxonómica, debido a que un subconjunto diferente de especies y / o genotipos pueden evolucionar en hábitats geográficamente distantes con condiciones ambientales similares. 5. La capacidad para detectar patrones biogeográficos debidos a ¿procesos históricos¿ depende de la resolución taxonómica. Mientras que la resolución proporcionada por el CARD-FISH, con sondas específicas para detectar desde filos hasta géneros, fue suficiente para detectar los efectos de los factores ambientales, fue necesaria una resolución más alta, como la proporcionada por el ARISA para detectar efectos históricos. 6. Las comunidades bacterianas en aguas costeras de Galicia mostraron estacionalidad y sincronía espacial en relación con la dinámica estacional de afloramiento-hundimiento, a pesar de que la estacionalidad fue más evidente en las aguas de superficie que en la base de la zona eufótica. 7. Las comunidades bacterianas en aguas costeras de Galicia presentaron mayor diversidad y similitud horizontal y vertical durante el período de hundimiento que durante el período de afloramiento probablemente debido a la mezcla invernal. 8. La estructura de la comunidad bacteriana en aguas costeras de Galicia mostró homogeneidad horizontal en escalas <150 kilómetros, y heterogeneidad vertical a escalas <50 m. 9. Los flujos de carbono mediados por bacterias en aguas costeras de Galicia estuvieron controlados principalmente por la estructura de la comunidad bacteriana en las aguas superficiales y por factores ambientales locales en la base de la zona eufótica. 10. Se detectaron varios grupos de poblaciones bacterianas que coexisten y que responden de manera similar a factores locales y regionales, y que probablemente realizan funciones similares o complementarias. La mayoría de los grupos incluyeron poblaciones pertenecientes a diferentes grupos filogenéticos, lo que sugiere la adaptación a nichos similares de poblaciones alejadas filogenéticamente.