Estudio experimental de la patología y distribución de dos estirpes de lentivirus de pequeños rumiantes mediante la utilización de dos vías de inoculación en ovino

Resumen

Los lentivirus son un subgrupo de virus de la familia Retroviridae, que infectan a una amplia gama de especies animales, y causan infecciones lentas que pueden conducir a enfermedades degenerativas progresivas. A este grupo pertenecen los lentivirus de los pequeños rumiantes (Small ruminant lentivirus, SRLV), entre los cuales se encuentran el virus Visna/Maedi (Visna/maedi virus, VMV) y el virus de la artritis encefalitis caprina (Caprine arthritis-encephalitis virus, CAEV) que infectan tanto a las ovejas como a las cabras y que conducen a la aparición de las enfermedades conocidas como Visna/maedi (V/m) y artritis encefalitis caprina (Caprine arthritis-encephalitis- CAE) respectivamente. Estas enfermedades causan grandes pérdidas económicas debido al desvieje prematuro de los animales, a la reducción de la productividad y fertilidad, a la disminución del número de corderos y de su peso al nacer y al aumento de mortalidad. En los SRLV se describen 5 genotipos (A-E), que presentan una alta variabilidad genética y biológica y que conllevan a cuadros clínicos distintos de la enfermedad. Al genotipo A pertenecen las estirpes clásicas del VMV y al genotipo B de las estirpes clasicas de CAEV. Los SRLV causan lesiones principalmente en los pulmones, sistema nervioso central (SNC), articulaciones y glándula mamaria. En el presente estudio, se han utilizado dos estirpes de SRLV, las estirpes 697 y 496. La estirpe 697 fue aislada de un brote de la forma nerviosa caracterizado por la aparición de síntomas neurológicos en ovejas de la raza Assaf infectadas por SRLV en la comunidad autónoma de Castilla y León. Su secuenciación reveló una nueva estirpe neuropatogénica. La estirpe 496 fue aisalada en ovejas de la rasa Raza Aragonesa, de la Comunidad Autónoma de Aragón, donde la infección por VMV se caracterizó principalmente por artritis proliferativa y neumonía. Se obtuvieron secuencias víricas de este brote de artritis y posteriormente se secuenció completamente el genoma viral. Dicho estudio reveló una estirpe filogenéticamente próxima al subrgupo B2 del tipo CAEV, resultados que revelaron un vínculo entre el grupo genético y la forma de la enfermedad. Para estudiar el comportamiento biológico, la distribución y las lesiones producidas por las dos estirpes (697 y 496), se han utilizado dos vías de infección. En un primer experimento se utilizó la vía intramedular y en un segundo la vía intratraqueal. En ambas infecciones se han utilizados corderos machos castrados, de la raza Rasa Aragonesa, provenientes de una ganadería acreditada oficialmente como libre de Visna/maedi (V/m). Previamente a la adquisición de los corderos tanto las madres como los corderos fueron testados frente a V/m por ELISA y PCR. En el primer experimento se utilizaron 15 corderos que fueron separados en 3 grupos, dos grupos de seis animales: grupo A (A1-A6) y grupo B (B1-B6) y un grupo control, grupo C (C1-C3) de tres animales. A los cinco meses de edad los corderos de los grupos A y B fueron infectados con las estirpes 697 y 496 respectivamente. Se utilizó una dosis individual del virus de 106TCID50 para las dos estirpes. Los animales control recibieron solamente el diluyente. La infección se realizó utilizando la vía intramedular en el húmero derecho. En el segundo experimento se utilizaron 20 animales los cuales fueron separados en 3 grupos, dos grupos de ocho animales: grupo N (N1-N8), grupo T (T1-T8) y un grupo control, grupo K (K1-K4) de cuatro animales. Se utilizaron las mismas dosis infectantes y la infección se realizó mediante la vía intratraqueal. Después de la infección se realizó un seguimiento clínico en los animales, y una toma de muestras sistemática de sangre para hemograma, evaluación del título serológico, presencia de virus por PCR, y expresión sanguínea por citometría de flujo de linfocitos T CD4+ y CD8+. En el primer experimento los animales fueron sacrificados a los 134, 273 y 319 dpi, y en el segundo experimento a los 217 y 570 dpi. La necropsia y toma de muestras se realizaron de manera idéntica en ambos experimentos. Se realizó un estudio macro y microscópico detallado de los animales con especial atención a los órganos diana de los SRLV (pulmón, articulación, SNC y linfonodos). Además de las técnicas rutinarias de histopatología, se realizaron estudios histomorfométricos del espacio alveolar e inmunohistoquímica (IHQ) para caracterización del infiltrado inflamatorio con los anticuerpos Anti-CD3, Anti-CD4, Anti-CD8, Anti-CD68 y para la detección viral con el anticuerpo CAEP5A1. También se realizó una identificación y cuantificación de la carga proviral en tejidos por qPCR. Todos los animales fueron infectados con éxito en ambos experimentos, como se ha demostrado por los resultados de serología y/o PCR. Sin embargo los animales infectados por la estirpe 496 (grupos B y T) tuvieron una respuesta serológica más intensa y un mayor número de resultados positivos por PCR que los animales infectados por la estirpe 697 (grupo A y N). Ningún animal control se infectó durante todo el tiempo experimental en ambas infecciones. Los resultados macro y microscópicos demostraron una moderada a severa artritis proliferativa y neumonía intersticial en la inmensa mayoría de los animales de los grupos B y T. Sin embargo los animales de los grupos A y N no presentaron lesiones importantes en el SNC, aunque en algunos animales se veía una modera a severa neumonía intersticial. El estudio inmunohistoquímico demostró una intensa infiltración de linfocitos T y macrófagos en las zonas articulares afectadas. El infiltrado peribronquiolar presente en los animales infectados era predominantemente compuesto por linfocitos T. Se observó además un predominio de linfocitos T CD4+ sobre linfocitos T CD8+ tanto en las lesiones en carpo como en el pulmón. Se detectaron virus tras el estudio por IHQ en el carpo y linfonodos preescapulares y axilares de los animales del grupo B y T y en el pulmón y linfonodo mediastínico de los animales de los grupo B, T y N. Con respecto a la carga proviral por qPCR, se detectaron virus en tejidos como pulmón, carpo, SNC y linfonodo de animales del grupo B, T y N. Basado en la cantidad e intensidad de lesiones, respuesta serológica, resultados positivos para PCR en sangre y partículas virales encontradas en todos los animales experimentalmente infectados, se concluye que la estirpe 496 es más virulenta y patogénica que la 697. Además ambas vías de infección son eficientes para el establecimiento de la infección. Sin embargo en la infección por la vía intratraqueal se observan más cantidad e intensidad de lesiones que por la vía intramedular, cuando comparamos las lesiones en los sacrificios realizados en el mismo dpi. La estirpe 496 fue la única en reproducir las lesiones del aislado original, produciendo las lesiones articulares y además lesiones en el SNC. La estirpe 697 no fue capaz de producir lesiones importantes en el SNC en los animales, aunque sí las produjo en el pulmón y fue detectada en otros tejidos tras la utilización de técnicas de PCR e IHQ. El hecho de no haber lesiones importantes en el SNC de los animales infectados por la estirpe 697 (origen nerviosa) puede ser atribuido a una baja virulencia de la estirpe y/o a una resistencia por parte de las ovejas de la raza Rasa Aragonesa a este tipo de forma clínica.