Proteínas ancestralesreconstrucción y caracterización energética, funcional y estructural

Resumen

En la presente memoria para la obtención del grado de Doctor por la Universidad de Granada abordamos la resurrección y caracterización energética, biofísica y estructural de tiorredoxinas ancestrales pertenecientes a organismos extintos del periodo Precámbrico (4.5 a 0.5 mil millones de años antes del presente, aproximadamente). Este estudio tiene implicaciones evolutivas, ya que contribuye a ampliar la información sobre el entorno físico que rodeaba a los organismos extintos, así como implicaciones en ingeniería de proteínas, ya que las proteínas ancestrales estudiadas presentan unas propiedades alteradas, inusuales o extremas en términos de estabilidad o actividad catalítica. La presente memoria comienza con una introducción general en la que repasamos brevemente la historia de la resurrección de proteínas ancestrales y discutimos las implicaciones evolutivas y en ingeniería de proteínas que tiene este enfoque. A continuación detallamos las diferentes etapas en las que hemos llevado a cabo el trabajo de esta tesis doctoral y enumeramos los objetivos concretos que nos hemos propuesto. Seguidamente, explicamos detalladamente cada uno de los procedimientos experimentales utilizados para la consecución de los resultados expuestos en la presente memoria. Cabe destacar que, para la caracterización de las tiorredoxinas ancestrales ha sido necesario utilizar gran diversidad de técnicas experimentales (ensayos bioquímicos, cristalografía de rayos-X, calorimetría diferencial de barrido, procedimientos de biología molecular, etc.) Tras los detalles técnicos, mostramos los resultados de la primera etapa del trabajo, que ha consistido en la expresión, purificación y caracterización biofísica de siete tiorredoxinas ancestrales pertenecientes a organismos del período Precámbrico. Las tiorredoxinas resucitadas son extremadamente estables, presentando temperaturas de desnaturalización hasta unos 30-35 grados superiores a las de las tiorredoxinas actuales. Además, las tiorredoxinas resucitadas más antiguas (~ 4 mil millones de años antes del presente) muestran una actividad, tanto a pH 7.0 como a pH 5.0, mucho más elevada que las tiorredoxinas actuales. A partir de los resultados obtenidos, podemos concluir que las tiorredoxinas ancestrales emplean mecanismos de reducción similares a los de las tiorredoxinas actuales. Aunque han mantenido su mecanismo de reducción inalterado, sí han sido capaces de adaptarse a lo largo de la evolución a los cambios del entorno en términos de temperatura y acidez. Para tratar de incrementar el alcance y las implicaciones de la resurrección de proteínas ancestrales, hemos llevado a cabo la resolución de las estructuras tridimensionales de las siete tiorredoxinas resucitadas mediante cristalografía de rayos-X. Además, hemos realizado un detallado análisis comparativo de las estructuras de las tiorredoxinas ancestrales con las tiorredoxinas actuales de Escherichia coli y humana. Los resultados de este estudio muestran que la estructura de las tiorredoxinas han experimentado pocos cambios a lo largo de 4 mil millones de años, por lo que puede considerase como un fósil molecular. Los pequeños cambios observados en las estructuras, relacionados principalmente con los ancestros de las tiorredoxinas eucariotas, proporcionan una interpretación evolutiva a las diferencias estructurales de las tiorredoxinas de E. coli y humana. Estos resultados sugieren que la resurrección ancestral de proteínas puede constituir una herramienta muy útil para estudiar la evolución de la estructura de las proteínas. Dado que disponemos de las estructuras de tiorredoxinas precámbricas estamos en un posición única para estudiar los mecanismos moleculares responsables de la alta estabilidad observada en las tiorredoxinas resucitadas. Con este objetivo, hemos realizado un estudio computacional comparativo de las estructuras de las tiorredoxinas ancestrales y las tiorredoxinas actuales de E. coli y humana, dirigido a evaluar las diferentes contribuciones energético/estructurales (interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, entropía conformacional, etc.) a la estabilidad de estas proteínas. Los resultados de este estudio muestran contribuciones significativas en lo que respecta a la propensión de los residuos por alfa hélices, cavidades internas y a parámetros relacionados con la entropía conformacional del estado desplegado (número de prolinas y glicinas). Finalmente, hemos llevado a cabo un análisis mutacional de la hiperestabilidad de la tiorredoxina LPBCA (121ºC de Tm), en comparación con la tiorredoxina actual de E. coli (87.3ºC de Tm). En este estudio nos hemos centrado en el número de prolinas y de glicinas, así como en la mutación no conservativa K90L y los residuos próximos en la estructura a dicha posición. Para llevar a cabo este análisis experimental, hemos utilizado un enfoque de bibliotecas combinatoriales de variantes de tiorredoxinas, en combinación con la regresión de mínimos cuadrados parciales. Los resultados del análisis experimental muestran que con tan solo 11 mutaciones pueden explicarse alrededor de 29ºC de la diferencia de estabilidad (de 33ºC) entre las tiorredoxinas analizadas. Estos resultados podrían tener implicaciones generales, pues sugieren que el estudio de algunas mutaciones no conservativas (y los residuos próximos en estructura) podría ser utilizado en ingeniería de proteínas para modificar la estabilidad de las proteínas.