Biodiversidad y ecología funcional de bacterias desnitrificantes

Laburpena

La contaminación por nitratos (NO3-) en el medio ambiente es cada vez más frecuente e intensa. El nitrógeno (N) es el elemento más abundante en la atmósfera aunque no puede utilizarse directamente por las plantas y animales. Las bacterias fijadoras de dinitrógeno (N2) atmosférico son los únicos seres vivos capaces de reducirlo a amonio, lo que inicia su uso en la naturaleza. Desde la revolución verde a finales de los años 60, el ciclo del N se ha alterado gravemente por el exceso de NO3- procedente de los fertilizantes nitrogenados que, junto con el procedente de los purines del ganado y las aguas residuales e industriales, se acumula en la corteza terrestre. Consecuentemente, se produce una contaminación por nitratos de suelos, sedimentos y aguas, lo que supone una seria amenaza para la salud animal y humana. La desnitrificación es el único proceso biológico por el que los nitratos pueden eliminarse, evitando así su acumulación. Este proceso es un mecanismo alternativo de respiración por el que, en condiciones limitantes de oxígeno, el nitrato se reduce secuencialmente a nitrito (NO2-), óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N2O) y, finalmente, a dinitrógeno molecular (N2), que se libera de nuevo a la atmósfera completándose así el ciclo del N. Estas reacciones son catalizadas por las enzimas nitrato reductasa, nitrito reductasa, óxido nítrico reductasa y óxido nitroso reductasa, codificadas por los genes narG/napA, nirK/nirS, c-nor/q-nor y nosZ, respectivamente. Paradójicamente, en este proceso se producen los intermediarios NO y N2O que son importantes gases de efecto invernadero, por lo que su formación durante la desnitrificación supone una fuente de contaminación atmosférica. Mientras que los aspectos fisiológicos, bioquímicos y genéticos de la desnitrificación se conocen en profundidad, apenas existe información sobre la abundancia o escasez de las distintas poblaciones desnitrificantes en diferentes hábitats, las bacterias desnitrificantes predominantes en un ecosistema concreto, y cómo la actividad funcional de la comunidad varía en el tiempo. Igualmente, se desconoce el efecto del contenido en nitratos sobre la abundancia, biodiversidad, distribución espacial y actividad funcional de la comunidad desnitrificante. Para ello, utilizando como modelo el Espacio Natural de Doñana (END), se analizó el contenido en nitratos, actividad desnitrificante, propiedades físico-químicas, abundancia relativa y biodiversidad de las poblaciones desnitrificantes. El estudio se prolongó en los años 2008, 2009 y 2010 y se tomaron muestras en los meses de abril y octubre que corresponden a las fechas de mayor y menor pluviosidad, respectivamente. Los resultados de esta Memoria de Doctorado indican la existencia de contaminación por nitratos en los sedimentos del END, con valores de concentración superiores a los máximos establecidos por las autoridades españolas y europeas. Está contaminación presenta variaciones espacio-temporales que podrían deberse a cambios en la dinámica hídrica de los sedimentos del END. El estudio isotópico de los nitratos reveló su origen antrópico y podría deberse a las prácticas agrícolas que se realizan en el ecotono del END. La abundancia relativa de las distintas poblaciones desnitrificantes se estimó en la laguna del Acebrón y en el arroyo de la Cañada, sitios con menor y mayor contenido en nitratos, respectivamente. Para ello, se determinó el número de copias de los genes narG, napA, nirK, nirS y nosZ mediante qPCR. En general, las poblaciones desnitrificantes fueron más abundantes en el sitio con mayor contenido en nitratos y fueron superiores en el mes de octubre. Se puede concluir, por tanto, la existencia de variaciones espacio-temporales en la comunidad desnitrificante producida por variaciones en la concentración de nitratos. Para analizar el efecto del nitrato en la biodiversidad de la comunidad desnitrificante se construyeron genotecas del gen nosZ a partir del ADN aislado de los sedimentos. La biodiversidad, analizada como número de OTUs fue mayor en los sedimentos de octubre del arroyo de la Cañada. Junto a un aumento en la diversidad, se observa también una mayor homogeneidad en el número de individuos que conforman los distintos OTUs. La actividad desnitrificante en la laguna del Acebrón fue similar entre las fechas de muestreo y, por el contrario, en el arroyo de la Cañada fue superior en el mes de abril. Aunque la concentración de nitratos en el mes de octubre en arroyo de la Cañada fue superior a la del mes de abril, la actividad desnitrificante fue menor. Es posible que este desajuste entre contenido en nitratos y actividad desnitrificante se deba a la disminución del caudal del arroyo, lo que resultaría en un aumento de la tensión de oxígeno en los sedimentos, y daría lugar, a su vez, a la inhibición de esta actividad. En este trabajo se ha demostrado la existencia de correlación entre el contenido en nitratos y la abundancia relativa de las poblaciones desnitrificantes. El análisis estadístico realizado indica que el gen nosZ es el que presenta una correlación más fuerte con el contenido en nitratos. Por otra parte, se ha puesto en evidencia la relación entre la diversidad de bacterias desnitrificantes de las muestras de sedimentos y el contenido en nitratos. En contraste con otros estudios, nuestros datos indican que la actividad desnitrificante es independiente del contenido en nitratos y de la abundancia de la comunidad desnitrificante. Finalmente se llevó a cabo un estudio sobre la distribución espacial de las poblaciones desnitrificantes. Se ha utilizado para ello el humedal artificial de los Guayules, balsa que se construyó con la finalidad de depurar las aguas contaminadas con nitratos que procedentes de las zonas agrícolas que rodean el END llegan a la marisma del Rocío. Este trabajo fue pionero en el análisis de la distribución espacial de comunidades desnitrificantes en humedales de agua dulce y puso de manifiesto que su análisis debe realizarse a espacios inferiores a los 5 m que se emplearon en nuestro estudio, como así lo mostraron los mapas de Krige que se elaboraron para las variables contenido en nitratos, actividad desnitrificante y abundancia relativa de las genes narG, napA, nirK, nirS, y nosZ. Los valores de autocorrelación obtenidos mediante el análisis de semivarianza de cada uno de los genes de la desnitrificación demostraron que el gen nosZ es el que mejor ajuste estadístico posee y podría explicar de forma efectiva la distribución de la comunidad desnitrificante. Considerados el conjunto de resultados obtenidos, se propone el gen nosZ como marcador molecular para el estudio metagenómico y de la ecología funcional de la comunidad desnitrificante en sedimentos contaminados con nitratos.