Síntesis de oligosacáridos de ácido hialurónico y sulfato de condroitina y evaluación de sus interacciones con proteínas por polarización de fluorescencia

Resumen

INTRODUCCIÓN Los Glicosaminoglicanos o GAGs, una de las clases más importantes de moléculas extracelulares, son cadenas polisacarídicas lineales. Están formados por unidades disacarídicas repetitivas que consisten, en líneas generales, en un ácido urónico (ácido ¿-L-idurónico o ácido ß-D-glucurónico) unido a través de un enlace (1¿3) ó (1¿4) a un amino azúcar (N-acetil glucosamina o N-acetil galactosamina). Podemos catalogar los GAGs en cuatro grandes familias: la primera constituida por el sulfato de heparano (HS) y la heparina; una segunda, a la que pertenecen el sulfato de condroitina (CS) y el sulfato de dermatano (DS); el sulfato de queratano (KS) y, finalmente, el ácido hialurónico (HA). La gran complejidad estructural de los GAGs y, en consecuencia, la elevada densidad de información que éstos contienen derivan de su biosíntesis. Una de las consecuencias de la inmensa diversidad estructural de los GAGs es que estas moléculas son capaces de unirse e interactuar con una amplia variedad de proteínas, tales como factores de crecimiento, quimiocinas, morfógenos y enzimas. En esta Tesis Doctoral se han desarrollado estrategias sintéticas para la preparación de oligosacáridos de ácido hialurónico y de sulfato de condroitina. Las limitaciones que se pueden encontrar en el aislamiento de estas biomoléculas de fuentes naturales hacen que la síntesis química de GAGs se presente como una alternativa muy interesante, mediante la cual se puede preparar prácticamente cualquier glicosaminoglicano con un elevado control en la estereoquímica, el tamaño y el patrón de sulfatación. La obtención de estructuras bien definidas facilita la identificación de secuencias biológicamente activas y la obtención de relaciones estructura-actividad, lo cual permite analizar el potencial terapéutico de los glicosaminoglicanos, en áreas como la biología del cáncer, la neurobiología y la virología. OBJETIVOS 1. Preparación de oligosacáridos de ácido hialurónico para el estudio, a nivel molecular, de sus interacciones con proteínas, como langerina y CD44, mediante experimentos de RMN. 2. Evaluación el uso de etiquetas perfluoradas para facilitar las purificaciones de los intermedios de reacción. 3. Desarrollo de una nueva ruta sintética para la obtención de oligosacáridos de sulfato de condroitina, usando nuevos bloques monosacarídicos de N-acetil galactosamina, protegidos con un grupo N-trifluoroacetilo. 4. Puesta a punto de experimentos basados en medidas de fluorescencia para evaluar la interacción de los oligosacáridos GAG sintetizados con determinadas proteínas. METODOLOGÍA Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS El desarrollo de una estrategia sintética en la que se usan directamente bloques de ácido glucurónico en las reacciones de glicosidación ha permitido la preparación de oligosacáridos de ácido hialurónico. Con el objetivo de optimizar la primera aproximación sintética, se estudió el uso de unidades monosacarídicas parcialmente benciladas, más reactivas, incrementando así los rendimientos de las glicosidaciones y minimizando la formación de productos secundarios. La eficiencia de esta estrategia se ha demostrado con la síntesis total de fragmentos de ácido hialurónico de tamaño di-, tri- y tetrasacarídico. Estos productos finales han resultado ser unos ligandos excelentes para estudiar, a nivel molecular, las interacciones entre el ácido hialurónico y determinados receptores proteicos, como la langerina, mediante técnicas de RMN y modelización molecular. En paralelo, se ha abordado la síntesis de un fragmento trisacarídico de ácido hialurónico asistida por etiquetas perfluoradas. Esta metodología nos permitió la purificación de los intermedios de reacción mediante extracción sólida utilizando una sílica gel perfluorada, evitando así las dificultades inherentes a la realización de múltiples purificaciones cromatográficas características de la síntesis de oligosacáridos clásica. En el diseño de una estrategia sintética para la obtención de oligosacáridos de sulfato de condroitina, se estudió el uso de unidades de galactosamina en las que la función amino se ha protegido temporalmente con un grupo trifluoroacetilo. Este patrón de grupos protectores ha resultado ser eficaz para la preparación de oligómeros con buen rendimiento. El grupo trifluoroacetilo condujo a la formación selectiva de los 1,2-trans glicósidos deseados y, al mismo tiempo, pudo ser fácilmente desprotegido al final de la secuencia sintética para generar los productos finales N-acetilados. La compatibilidad del diseño sintético desarrollado con las etapas finales de desprotección/sulfatación se demostró con la preparación de un tetrasacárido heptasulfatado. Utilizando los oligosacáridos sintetizados en esta Tesis Doctoral y en nuestro grupo de investigación, se han desarrollado experimentos basados en medidas de fluorescencia para la evaluación de las interacciones entre oligómeros sintéticos de tipo glicosaminoglicano y las correspondientes proteínas. En una primera aproximación, oligosacáridos sintéticos de heparina se inmovilizaron de forma covalente a los pocillos de una microplaca convenientemente funcionalizada. Para la detección de la proteína enlazada se emplearon los correspondientes anticuerpos. De esta manera, se pudieron determinar las constantes de disociación relativas para la interacción carbohidrato-proteína. Por otro lado, se ha desarrollado también un experimento de polarización de fluorescencia que permitió estimar las afinidades relativas de los oligosacáridos sintéticos en solución, sin necesidad de funcionalizarlos para tal fin, ni unirlos a una superficie sólida, lo que supone una gran ventaja. A través de este ensayo de competición se pudieron analizar y comparar, rápidamente, las actividades de un gran número de compuestos, utilizando una cantidad mínima de muestra.