Purificación y caracterización de trwb de r388, una proteína integral de membrana esencial en la conjugación bacteriana

Resumen

LA CONJUGACION ES UN PROCESO GENERAL DE TRANSFERENCIA GENETICA ENTRE BACTERIAS QUE REQUIERE UN CONTACTO FISICO ENTRE LAS CELULAS. LA MAYORIA DE LOS SISTEMAS DE CONJUGACION EN BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS SE ENCUENTRAN CODIFICADOS EN PLASMIDOS Y SE CARACTERIZAN POR POSEER UN PILUS CONJUGATIVO. R388 ES UN PLASMIDO CONJUGATIVO AISLADO ORIGINALMENTE DE E. COLI. LA REGION DONDE SE CODIFICAN LOS GENES NECESARIOS PARA LA TRANSFERENCIA CONJUGATIVA DE R388 OCUPA 14,9 KB, Y SE DIVIDE EN DOS ZONAS: UNA NECESARIA PARA LA FORMACION DEL PILUS Y OTRA QUE CODIFICA LAS PROTEINAS QUE PREPARAN EL DNA PARA SU TRANSFERENCIA, LO QUE SE CONOCE COMO MOVILIZACION. TRWB ES UNA PROTEINA DE R388 NECESARIA PARA LA MOVILIZACION DEL PLASMIDO. TAMBIEN ES IMPRESCINDIBLE PARA LA TRANSFERENCIA DE PLASMIDOS MOVILIZABLES COMO RSF1010 Y COLEI. TRWB JUNTO CON OTRAS PROTEINAS DE OTROS SISTEMAS (COMO TRAD DE F, TRAG DE RP4 Y VIRD4 DE PLASMIDOS TI) FORMAN UNA FAMILIA DE PROTEINAS ESENCIALES PARA LA CONJUGACION. EL PAPEL DE ESTAS PROTEINAS ES AUN DESCONOCIDO PERO SE HA PROPUESTO QUE ACTUEN COMO EL APARATO MOLECULAR QUE ACOPLA EL RELAXOSOMA Y EL COMPLEJO DE TRANSPORTE DEL DNA. EN LA PRESENTE TESIS SE HA PURIFICADO TRWB Y SE HA DEMOSTRADO QUE ES UNA PROTEINA INTEGRAL DE MEMBRANA LOCALIZADA EN LA MEMBRANA INTERNA DE LA CELULA. LA PURIFICACION DE TRWB SE HA REALIZADO EN CUATRO PASOS: SOLUBILIZACION CON CHAPS 18 MM, CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD A CIBACRON BLUE, TAMIZADO MOLECULAR Y CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD A HEPARINA. SE HA DEMOSTRADO QUE TRWB ES CAPAZ DE UNIR E HIDROLIZAR ATP. PROBABLEMENTE TRWB DESEMPEÑE UN PAPEL ACTIVO EN LA CONJUGACION APORTANDO LA ENERGIA NECESARIA PARA LA TRANSFERENCIA DEL DNA O ACTUANDO COMO SEÑAL DE LA FORMACION DEL PAR CONJUGATIVO.