Early detection of grapevine fungal foliar diseases and host and non-host defence responses against plasmopara viticola infection

Resumen

Los tres patógenos que mayoritariamente afectan al cultivo de la vid (Vitisvinifera L.) son Plasmopara viticola (Berck. & M.A. Curtis) Berl. & De Toni in Sacc.,Erysiphe necator [Uncinula necator (Schw.) Burr.], causantes del mildiu y oídio de lavid, respectivamente, y Botrytis cinerea Pers., patógeno no específico de la vid quecausa la enfermedad conocida como botritis, moho gris o podredumbre gris. Los tresafectan enormemente al sector vitivinícola, ya que disminuyen el rendimiento delcultivo y la calidad final de la fruta, ocasionando grandes pérdidas de producción yeconómicas (Peruzzi, 2007).La aplicación de fungicidas sigue siendo el principal medio para el tratamientode las enfermedades en el viñedo (Brent y Hollomon, 2007). El uso masivo detratamientos orgánicos e inorgánicos en los viñedos, generalmente aplicados en base acalendarios basados en los estadíos fenológicos de la vid (Buggiani et al., 1995), se hatraducido en una mayor concentración de estos contaminantes en los suelos (Flores-Vélez et al., 1996; Brun et al., 2003; Viti et al., 2007; Komárek et al., 2010), las aguassubterráneas (Kolpin et al., 1998; Ribolzi et al., 2002; Hildebrandt et al., 2008), enefectos perjudiciales sobre la salud humana (Schutz y Kunkee, 1977; Bourbos et al.,1998) y en la calidad del vino (Tromp y de Klerk, 1988; Cus et al., 2010), así como enla aparición de resistencias inducidas en los hongos diana (Délye et al., 1997; Chen etal., 2007; Baudoin et al., 2008; Leroch et al., 2010).El manejo integrado de plagas (Integrated Pest Management, IPM) se basa endiferentes estrategias y prácticas de manejo del cultivo con el fin de controlar lasenfermedades reduciendo el uso de fitoquímicos (FAO, 2012), y se han convertido enuna forma atractiva para el control de plagas y enfermedades en la agricultura, siendotambién el caso de la viticultura (Oliva et al., 1996, 1999; Cesnik et al., 2008; Mansouret al., 2011).En este trabajo se estudian dos métodos para el control de enfermedades en viña:(1) un sistema de detección e identificación temprana de las esporas de los trespatógenos de interés, previa a la aparición de síntomas en plantas (Capítulo I), y (2) elestudio de la resistencia a P. viticola de diferentes cultivares de vid y una especie nohospedadora natural a lo largo del proceso de infección mediante análisis macroscópico,microscópico y transcriptómico (Capítulos II y III).Una de estas estrategias de IPM se basa en el seguimiento de la presencia y laseveridad de las plagas y enfermedades en la viña, lo que contribuiría a una aplicaciónmás moderada de fitoquímicos (Cséfalvay et al., 2009). La mayoría de los patógenos delas plantas, incluyendo el mildiu, oídio y botritis estudiados en este trabajo, se dispersanpor el aire en forma de esporas, por lo que el monitoreo de las mismas se consideracomo un buen indicador del riesgo de aparición de la enfermedad (Jeger, 1984; Lucas,2001; West et al., 2008).En este trabajo se ha diseñado un método de PCR (Polymerase Chain Reaction)multiplex para la detección e identificación simultánea y rápida de esporas recogidas entrampas de captura en viñedo. Hasta ahora, la tecnología de PCR ha sido aplicada conéxito para la detección de esporas de patógenos de plantas en diferentes cultivos(Calderón et al., 2002; Freeman et al., 2002; Luo et al., 2007; Carisse et al., 2009), loque supone un ahorro de tiempo en la detección de las mismas en comparación con eltradicional recuento e identificación al microscopio de las espora, ya que la presencia depolvo y otros hongos en las muestras podrían interferir en los resultados debido a lamorfología similar a las esporas de interés (Ma et al., 2003).Como las muestras recogidas en campo a menudo llevan adheridas a lasuperficie compuestos como polvo, partículas de suelo, polen o residuos defitoquímicos, los cuales pueden disminuir la cantidad de ADN extraído, aumentando ellímite de detección de la reacción de PCR (Keswani et al., 2005), o directamente inhibirla reacción (Loeffler et al., 1999), en esta técnica de PCR multiplex se ha incluido unaetapa de lavado de las muestras de campo antes de la lisis de las esporas y la liberaciónde ADN. Este lavado se llevó a cabo con diferentes tampones que contenían EDTABSAy dietilditiocarbamato.Esta técnica resultó ser eficiente en la detección e identificación de esporas delos patógenos de vid tanto muestras preparadas artificialmente en el laboratorio, a lasque se les añadieron diferentes componentes fitoquímicos, así como en trampas deesporas ambientales recogidos en la viña. Se trata, por tanto, del primer método de PCRpara la rápida detección e identificación simultánea de esporas de P. viticola, E. necatory B. cinérea a partir de trampas colectoras de esporas recogidas en campo, con el fin deproporcionar la detección antes de que los síntomas sean detectados en la planta.Otro objetivo importante para el IPM consiste en el cultivo de plantas resistentesa enfermedades (Bisson et al., 2002). Los cultivares europeos de V. vinifera muestranniveles de resistencia a enfermedades muy bajo. Sin embargo, las especies silvestres deResumen tesis Vanesa Huerga BarreiraVitis procedentes de América o Asia (V. riparia, V. rupestris o V. rotundifolia), asícomo Muscadinia rotundifolia, se consideran parcial o altamente resistentes a diferentespatógenos (Bulit y Lafon, 1978; Olmo, 1986; Eibach et al., 1989; Alleweldt et al., 1990;Mullins et al., 1992; Staudt y Kassemeyer, 1995).En este estudio, se ha analizado la resistencia/susceptibilidad al mildiu de la viden hojas de diferentes cultivares de V. vinifera: Solaris (SOL), Cabernet Sauvignon(CS), Tempranillo (TEM) y Petit Courbu (PC), así como de una especie no hospedadoranatural, Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotipo Columbia (AT). La resistencia de unaespecie no-hospedadora es conocida como resistencia no-hospedadora o no-huésped yparece poseer mecanismos de resistencia comunes a la resistencia basal de plantas. Losdiferentes cultivares de V. vinifera se clasificaron, por medio de la observaciónmicroscópica, de acuerdo con la capacidad de P. viticola para invadir y desarrollarsedentro de las hojas, desde el enquistamiento de las zoosporas en los estomas hasta laformación de esporangióforos macroscópicamente visibles. La resistencia al mildiutambién se evaluó mediante el análisis de la expresión de genes de defensa a lo largo deltiempo de infección (0-24 horas post inoculación (hpi)). La transcriptómica esactualmente una de las técnicas más sensibles para el análisis de la expresión génica(Charrier et al., 2002; Kim et al., 2003; Czechowski et al., 2004; Bustin et al., 2005;Goncalves et al., 2005; Terrier et al., 2005; Jain et al., 2006).Las principales diferencias entre los especímenes estudiados se observaron apartir del momento de penetración de las hifas del patógeno en el mesófilo de la hoja, encomparación a los estadíos iniciales de la infección, pues inicialmente tras lainoculación, todos los especímenes mostraron estomas infectados por zoosporas. Enrelación al análisis transcriptómico de la infección, se validaron una serie de genes dereferencia para la posterior normalización de los datos obtenidos mediante la técnica dePCR transcriptasa reversa a tiempo real (qRT-PC). Para ello se utilizó la combinaciónde los genes de referencia elongation factor 1-alpha (EF-1a) y beta tubulin (bTUB) paraV. vinifera y tubulin 3 (TUB3), glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPC1) yactin 2 (ACT2) para A. thaliana. Posteriormente, se hizo el análisis de expresión de unaserie de genes de defensa, como PR-1 (Pathogenesis-Related Protein 1), PR-2(glucanasa), PR-8 (quitinasa III), CALL (calosa sintasa), el factor de transcripciónWRKY32, EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility 1) y NDR1 (non-race DiseaseResistance, en Vitis NHL1).Entre los cultivares de V. vinífera, SOL resultó ser el más resistente. Aunque seobservaron estomas infectados en la etapa inicial de 2 hpi, fue el cultivar que mostró elmenor porcentaje de estomas infectados, así como el menor número de zoosporasenquistadas por estoma. Más tarde, a las 6 hpi, cuando el patógeno desarrollado la hifaprimaria con haustorio primario en el mesófilo de la hoja (estructura del desarrollo de P.viticola conocida como S2, según Unger et al., 2007), el 31% de los estomas infectadosmostraron depósitos fluorescentes identificados como callosa. Las deposiciones decalosa se cree que actúan como una barrera mecánica para el desarrollo de P. viticola(Gindro et al., 2003) y, como se sintetiza en la etapa inicial de 6 hpi, parece ser unmecanismo de resistencia en SOL. Sin embargo, los niveles de expresión del enzimasintasa de calosa (CALL) en SOL no aumentaron significativamente hasta las 12 hpi, loque sugiere que este cultivar puede poseer suficientes niveles basales de expresión delenzima para combatir la infección. En esta misma etapa de infección (6 hpi), SOLactivó otras respuestas de defensa para combatir la infección de P. viticola. En primerlugar, el gen EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility 1) se sobreexpresó, lo que sugierela activación de la ruta de señalización del ácido salicílico (SA) durante la PTI (PAMPtriggered immunity) (Wiermer et al., 2005). La molécula de SA puede estar actuandocomo una molécula señal (Vlot et al., 2009) activando otros mecanismos de resistencia,tales como las enzimas degradativas ß-1,3-glucanasa (PR-2) y quitinasa III (PR-8),sobreexpresadas hasta las 24 y 12 hpi, respectivamente. Ambas podrían estardegradando las paredes celulares del patógeno y así, liberando componentes de su paredque pudieran actuar como moléculas inductoras de la síntesis de calosa (Brown et al.,1998; Gomez-Gomez et al., 1999). Todos estos mecanismos podrían conferir resistenciaa SOL frente a P. viticola.Estos perfiles de expresión génica durante la infección de P. viticola puedeexplicar el hecho de que el estadío de desarrollo del patógeno más frecuente fuese laestructura S2. La resistencia de SOL frente al mildiu de la vid se confirmó cuando no seobservaron síntomas macroscópicos de esporulación después de 5 dpi (days postinoculation).El uso de variedades de vid resistentes al mildiu constituye una estrategiaprometedora para controlar la enfermedad (Bisson et al., 2002). Los programas demejora de vid se basan en la creación de variedades resistentes mediante la introducciónde la resistencia procedentes de otras especies de Vitis, mantenimiento las característicasagronómicas (Peressotti et al., 2010). Tal es el caso de la variedad SOL, autóctona deFreiburg (Alemania) y resultado de múltiple retrocruzamientos, descrita como altamenteresistente al mildiu y otras enfermedades (Becker, 1994). Muy recientemente,Schwander et al. (2012) encontraron el gen de resistencia a P. viticola Rpv10 en unapoblación derivada de un cruce entre la cepa de vid Gf.Ga-52-42 y el cultivar Solaris.La investigación actual se centra en encontrar posibles genes candidatos responsables dela expresión de la resistencia frente a P. viticola y en el desarrollo de nuevos marcadoresmoleculares estrechamente ligados a Rpv10 así como en mejorar el cultivo de nuevasvariedades con ayuda de nuevos marcadores de resistencia.El cultivar CS mostró características intermedias entre SOL y TEM y PC. Elnúmero de zoosporas enquistadas por estoma fue mayor que en SOL y los depósitos decalosa menor que en SOL pero mayor que en TEM o PC. La estructura S2 fue la másabundante a las 6 y 24 hpi y se observó una leve formación de esporangióforos tras 5dpi.El cultivar TEM mostró alta susceptibilidad a P. viticola. En cuanto alporcentaje de estomas infectados por zoosporas se refiere, este fue similar a PC peromayor que en SOL o CS. De acuerdo con la frecuencia de las estructuras infecciosas deP. viticola a nivel intratisular, se observaron todos los estadíos característicos (S2-S6).También se observó un porcentaje de estomas infectados con depósitos de calosa menorque Sol y CS, lo que sugiere una falta de respuestas de defensa en este cultivar.Finalmente, después de 5 dpi, el patógeno desarrolló una esporulación densa.El PC cultivar resultó ser también muy susceptible a la infección de P. viticola.Como ocurrió en el TEM, mostró el porcentaje más alto de estomas infectados yzoosporas enquistadas por estoma en relación con el resto de los cultivares. Durante eldesarrollo del patógeno en el interior del tejido de la hoja, se observaron también todoslos estadíos característicos. A las 6 hpi, cuando vesícula subestomática con hifa primariay haustorio primario estaba presente, se observó un bajo porcentaje de depósitos decalosa, lo que sugiere una falta de activación del mecanismo de defensa en PC despuésde la infección. Estos datos están en concordancia con el análisis de la expresión génicade la sintasa de calosa, cuya expresión disminuyó hasta las 12 hpi. De acuerdo con losgenes de defensa PR-2 y PR-8, no mostraron ningún cambio en la expresión durante elexperimento, lo que sugiere que las actividades glucanasa y quitinasa pudieran ser tanbajas que no actuarían como inductores de la respuesta de defensa. Por otra parte, elfactor de transcripción WRKY32 también disminuyó su expresión. Se puede sugerir quela menor abundancia de WRKY32, así como de NHL1, no son suficientes para laactivación de otros mecanismos de resistencia. El mayor nivel de expresión de EDS1frente a NHL1 que sugiere la activación de PTI (Wiermer et al., 2005). Sin embargo,parece que esto no es suficiente para luchar contra la enfermedad. Así, la infeccióncausada por P. viticola parece afectar a los mecanismos de resistencia de PC y elpatógeno es capaz de invadir el tejido huésped con éxito, como se observa hasta 5 dpi,cuando se observa una esporulación densa.En este trabajo se ha estudiado también la llamada resistencia no-hospedadora(NHR), ya que se ha descrito que posee similitudes con la resistencia basal de plantas(Niks y Marcel, 2009). Además, los patógenos biotrofos, como es el caso de P. viticola,son adecuados para los estudios de NHR, ya que no matan las células invadidas(Mellersh y Heath, 2003). Para este estudio de utilizó la especie A. thaliana (AT) ya quees un modelo para el análisis genético y molecular en el estudio de las interaccionesplanta-patógeno (Dangl, 1993; Kunkel, 1996).En cuanto a la observación micro y macroscópica de la infección en hojas deAT, no se observaron diferencias significativas entre las especies Vitáceas y AT en elenquistamiento de zoosporas. A nivel intratisular, la frecuencia de formación devesículas con hifa primaria (S2) en el mesófilo de las células a las 6 hpi fue comparablea la obtenida en el CS y mayor incluso que en SOL, siendo además la estructurapredominante a lo largo de todo el ciclo de infección, lo que sugiere que esta especieposee eficaces barreras físicas o químicas frente a patógenos no adaptados. Lacaracterística más notable fue la ausencia de haustorios, lo que indica que el patógenono es capaz de adquirir nutrientes del huésped y así, su desarrollo se detiene.De acuerdo con la expresión de genes de defensa, se observó un incremento dela expresión de PR-8 a las 24 hpi, sugiriendo que la actividad de quitinasa III erasuficiente para limitar el desarrollo de P. viticola. La sobreexpresión de quitinasa III, encombinación con altos niveles basales de PR-1 en AT podrían conferir mayorresistencia a P. viticola. Se produjo también un incremento de la expresión de CALL yde AtWRKY32. Este último con los niveles de expresión similares a los de SOL, lo quepuede sugerir que AT está respondiendo rápidamente a P. viticola y que WRKY32podría ser uno de los responsables de conferir resistencia no hospedadora. Por último,los valores de expresión de EDS1, mayores que de NHL1, sugieren que juega un papelimportante en la defensa contra oomicetos en las especies no hospedadoras naturales.Finalmente, las hojas de AT infectadas mostraron respuesta hipersensible tras 3,4 y 5 dpi. Esta respuesta puede estar asociada con un conjunto coordinado e integradode las alteraciones metabólicas que son imprescindibles para impedir la entrada depatógeno (Goodman y Novacky, 1994).