Effect of multitargeted antifolate on human metastatic melanoma cell lines. Molecular pathways and resistance mechanisms

Abstract

El objetivo principal de este trabajo es determinar la actividad antitumoral del antifolato Pemetrexed (MTA) sobre modelos celulares de melanoma humano mediante la identificación de las rutas de muerte celular que activa e identificar los mecanismos moleculares implicados en la resistencia al fármaco. Para ello se ha analizado el efecto de MTA sobre la viabilidad celular tras la exposición a diferentes dosis del fármaco. Se han estudiado las rutas de muerte celular activadas mediante la observación de cambios morfológicos empleando distintas técnicas de microscopia, cambios bioquímicos mediante ensayos ELISA, inmunofluorescencia y western blots y se ha estudiado el ciclo celular mediante citometría de flujo. Por otro lado, se establecieron sublíneas celulares resistentes a MTA y a Dacarbazina (tratamiento estándar actual) a partir de las líneas iniciales. Se analizaron marcadores moleculares implicados en la resistencia a ambas drogas mediante análisis de arrays de baja densidad y los resultados se validaron mediante técnicas de silenciamiento (siRNA) y ensayos de expresión específicos. Finalmente, se valoró el potencial metastático de las cepas resistentes mediante el estudio de la capacidad de invasión y migración, ensayo de la herida y zimogramas. Además, se han determinado los niveles de integrinas implicadas en la adhesión celular mediante citometría de flujo.Basándonos en los resultados obtenidos se puede concluir que MTA induce apoptosis por vías dependientes e independientes de caspasas en líneas celulares de melanoma humano. Durante el proceso apoptótico MTA induce la regulación post-trascripcional de los efectores de la muerte celular. Esta regulación es dependiente de p53, limitando la actividad del antifolato a células que muestren actividad de p53. De manera paralela, MTA es capaz de actuar sobre la ruta mTOR/Akt reforzando el estímulo apoptótico. Finalmente, las células resistentes a MTA presentan una menor capacidad de invasión que las células sensibles al fármaco. Además, MTA muestra actividad citotóxica contra células de melanoma resistentes a Dacarbazina. Por todo ello, proponemos que MTA cumple con los requisitos para ser tenido en cuenta como una posible opción de tratamiento para pacientes de melanoma metastático y/o como tratamiento de segunda línea en pacientes que desarrollen resistencia a Dacarbazina.