Microspheres and nanoparticles to release rhegf as an advanced approach for skin regeneration

Resumen

Las heridas crónicas, definidas como, aquellas heridas cuyo proceso de cicatrización se ve retrasado en el tiempo, representan una epidemia silente que afecta a un amplio sector de la población, a la vez que constituye un reto para la salud pública y un desafío económico. En este sentido, la administración de factores de crecimiento, tales como el Factor de Crecimiento Epidérmico (rhEGF), resulta una estrategia prometedora para el tratamiento de este tipo de lesiones. No obstante, debido a la inestabilidad que presentan este tipo de moléculas proteicas en la zona de la lesión, la administración de factores de crecimiento que están involucrados en el proceso de cicatrización ha mostrado un éxito moderado. No obstante, con el objetivo de mejorar la eficacia de los tratamientos actuales basados en la administración de factores de crecimiento, la comunidad científica está desarrollando nuevas formulaciones que permitan su administración de forma más efectiva.Es por eso que en la introducción de la tesis se hace una extensa revisión de los actuales sistemas de liberación de factores de crecimiento, haciendo especial hincapié en las micro y nanoesferas poliméricas, nanopartículas lipídicas, nanofibras, hidrogeles y soportes sólidos. Además, en esta revisión se resumen los modelos animales actuales disponibles para la cicatrización de heridas y los ensayos clínicos y los medicamentos comercializados basados en la administración de factores de crecimiento indicados para el tratamiento de heridas crónicas.En base a lo anteriormente expuesto, el objetivo general de la presente tesis doctoral es desarrollar una nueva formulación del rhEGF basada en micro y nanopartículas que permita mejorar la eficacia de la formulación comercial Heberprot® (polvo liofilizado que contiene 75 µg de rhEGF que se administra de forma intralesional tres veces por semana).El trabajo experimental realizado para alcanzar este objetivo se divide en cuatro capítulos diferentes. CAPÍTULO 1:El primer capítulo de esta tesis doctoral tuvo como objetivo diseñar un sistema de liberación novedoso que permitiera la reducción de la frecuencia de administración y la dosis total administrada de rhEGF en comparación con el Heberprot® ya comercializado. Para ello, se decidió encapsular el rhEGF en microesferas (MS) poliméricas biodegradables y biocompatibles.Las microesferas se prepararon utilizando la técnica de doble emulsión/evaporación-extracción del solvente. En primer lugar, tan solo se utilizó el ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) como polímero en la preparación de las MS. No obstante, debido a la baja eficacia de encapsulación (EE) que demostraron tener estas MS, por un lado, se incorporó NaCl en el método de preparación, para aumentar la presión osmótica de la solución de tensioactivo y de la solución utilizada para la eliminación del disolvente orgánico, a fin de mejorar las propiedades de las MS. Este paso impidió la difusión del fármaco desde la MS al hacer la superficie MS más suave y más regular; haciendo que la EE se viera aumentada. Por otro lado, también se incluyo el alginato, un polisacárido natural con una estructura química similar a los componentes de la matriz extracelular (ECM), en la fase acuosa interna de la emulsión para aumentar la viscosidad de la misma. De este modo, se limitó la difusión del rhEGF de la MS y el aumentó EE. Una vez preparadas las microsesferas, estas fueron esterilizadas por radiación gamma para su posterior administración in vivo.Los estudios in vitro llevados a cabo en fibroblasto de ratón Balb/C 3T3 demostraron que la bioactiviadad del rhEGF no se veía comprometida ni después del proceso de encapsulación ni tras la esterilización gamma. Además, los estudios de migración celular también indicaron que la actividad del EGF no se veía afectada tras la encapsulación debido a que la herida creada en el estudio de migración cerró más rápido en aquellas células tratadas con EGF que en el grupo control.Finalmente, se evaluó la eficacia de una única administración intralesional de MS de rhEGF en un modelo de herida escisión total en ratas Wistar diabetizadas. Los resutados demostraron que las rhEGF MS eran más eficaces promoviendo la cicatrización en términos de porcentaje de cierre de herida, re-epitelización y resolución del estado inflamatorio que 5 dosis de rhEGF no-encapsulado.CAPÍTULO 2:En el segundo capítulo de esta tesis doctoral se desarrollaron nuevas formulaciones que permitieron una administración eficaz del rhEGF a través de vías de administración menos invasivas, como la vía tópica. La administración tópica es una ruta más cómoda e indolora que puede reducir los efectos sistémicos adversos debido a la menor biodisponibilidad sistémica del fármaco. Para ello, se desarrollaron por un lado, nanopartículas lipídicas sólidas cargadas con rhEGF (rhEGF-SLN) y por el otro, transportadores lipídicos nanoestructurados cargados con rhEGF (NLC-rhEGF).Los resultados in vitro llevados a cabo en fibroblastos de ratón Balb/C 3T3, fibroblasts humanos dermales y queratinocitos humanos revelaron que, ni el proceso de encapsulación, ni el de esterilización terminal por gamma afectaba la bioactividad del rhEGF. Además, es importante destacar, que estos estudios demostraron que el proceso de encapsulación no solo no afectaba la actividad biológica del factor de crecimiento sino que lo mejoraba significativamente. Estos resultados pueden deberse a que tanto las SLN-rhEGF como las NLC-rhEGF pueden unirse de forma continuada al receptor de EGF de la superficie celular (REGF) y activar la vía de señalización, lo que resulta en una mejora de la proliferación celular. Además, la internalización de estas NP en fibroblastos y queratinocitos podría estar también directamente relacionada con el aumento de la proliferación celular, ya que, la internalización NP pueden afectar significativamente al crecimiento y diferenciacón celular.Finalmente, se evalúo la eficacia in vivo de dos administraciones tópicas semanales de 10 y 20 ¿g de rhEGF-SLN y rhEGF-NLC en comparación con una sola administración intralesional de 75 ¿g rhEGF-MS y dos administraciones intralesionales semanales de 75 ¿g rhEGF libre en ratones transgénicos db/ db que tienen las cicatrización impedida. Estos resultados demostraron que cuatro dosis tópicas de 10 o 20 ¿g de SLN-rhEGF o NLC-rhEGF eran más efectivas promoviendo la cicatrización que el mismo número de administraciones intralesionales de 75 ¿g de rhEGF libre, e igualmente efectivas que una única administración intralesional de 75 ¿g de MS-rhEGF.CAPÍTULO 3:Después de los buenos resultados obtenidos en ratones db/db con las nanopartículas de rhEGF del anterior capítulo, el siguiente objetivo fue demostrar la eficacia de los nanoformulaciones en un modelo preclínico más relevante como es el cerdo. Debido a que las rhEGF-NLC mostraron una EE superior a las rhEGF-SLN, no requieren disolventes orgánicos para su preparación y ambas nanoformulaciones mostraron tener las misma eficacia in vitro e in vivo, en este capítulo tan solo se estudió la efectividad de 20 ¿g de rhEGF-NLC en un modelo porcino de cicatrización, en comparación con el NLC vacías y dos administraciones intralesionales semanales de 75 ¿g de rhEGF libre. Los resultados de este estudio revelaron que 20 ¿g derhEGF-NLC administrados por vía tópica eran más eficaces reduciendo el área de la herida que las NLC vacías, y al menos tan eficaz como el mismo número de la administración de 75 mg de rhEGF libre administrado por vía intralesional. De forma muy destacable, el examen histológico mostró que el día 15 de estudio las lesiones tratadas con rhEGF-NLC tópico alcanzaban una mayor longitud epitelial que le resto de grupos estudiados, incluyendo el grupo tratado con rhEGF libre.Por otro lado, la evaluación histológica también demostró que la madurez de la herida y la calidad de la cicatrización, el grado de resolución del estado inflamatorio así cómo el número de nuevos vasos formados de aquellos grupos tratados con rhEGF-NLC era superior que el resto de grupos. Todos estos datos son especialmente significativos porque las heridas tratadas con rhEGF-NLC recibieron dos dosis semanales de 20 ¿g de rhEGF administrado por vía tópica, mientras que los tratados con rhEGF libre recibieron dosis más altas (75 ¿g dos veces a la semana) administrados por vía intralesional. Estos datos demuestran que las rhEGF-NLC no sólo permiten una reducción significativa de la dosis de factor de crecimiento, sino también su administración tópica de una manera efectiva. Estos resultados, de acuerdo con varios autores, pueden atribuirse a la protección frente a las proteasas existentes en la herida que proporciona la nanoencapsulación. CAPÍTULO 4:En el último capítulo de esta tesis doctoral se busco desarrollar un sistema de libración apropiado para las rhEGF-SLN y las rhEGF-NLC. Para ello, las nanopartículas fueron incorporadas en tres vehículos diferentes: un hidrogel mucoadhesivo que permite prologar significativamente el tiempo de permanencia de las formulaciones en la piel, llamado Noveon®, un hidrogel anfifilico que se trasforma de una solución acuosa a un hidrogel semisólido al incrementar la temperatura de 4ºC a 23 ºC, llamado Pluronic F-127 y un soporte sólido de fibrina que es un importante mediador hemostático. A continuación, estos sistemas de liberación integrados fueron caracterizados para evaluar la liberación de rhEGF y la disposición de nanopartículas a través de la piel intacta y parcialmente dañada en un modelo ex vivo de piel de cerdo.En ninguno de los estudios realizados se observaron diferencias significativas entre rhEGF-SLN y rhEGF-NLC, sea cual sea el vehículo. En todos los casos, el rhEGF liberado de las nanopartículas permaneció principalmente en las capas más superficiales de la piel. Además, tal y cómo se pudo confirmar en los estudios de microscopía confocal las NP marcadas permanecieron en la parte superior de la piel actuando como reservorios para proporcionar una liberación sostenida de rhEGF. Teniendo en cuenta que los soportes de fibrina pueden tener una mayor estabilidad a largo plazo que ambas formulaciones semisólidas y debido a sus propiedades homeostáticas , se podría concluir que el soporte a base de fibrina puede ser la alternativa más adecuada para la formulación de las nanopartículas lipídicas cargadas con rhEGF. Sin embargo, antes de decidir el vehículo más apropiado, resulta necesario realizar estudios de estabilidad a largo plazo y estudios in vivo en animales con cicatrización impedida.De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo experimental, las principales conclusiones son: - Una sola administración de microesferas de PLGA-Alginato desarrolladas han demostrado ser eficaz promoviendo una cicatrización más rápida y eficiente que 5 dosis de rhEGF no-encapsulado en un modelo de herida por escisión total en ratas Wistar diabetizadas.- Los experimentos llevados a cabo en ratones db/db mostraron que cuatro dosis tópicas de 10 o 20 ¿g de SLN-rhEGF o NLC-rhEGF eran más efectivas promoviendo la cicatrización que el mismo número de administraciones intralesionales de 75 ¿g de rhEGF libre, e igualmente efectivas que una única administración intralesional de 75 ¿g de MS-rhEGF.- La radiación gamma podría ser un proceso apropiado para la esteilización terminal de las rhEGF-MS y rhEGF-NP.- De acuerdo a los estudios realizados en un modelo porcino de herida por escisión total, 20 ¿g de rhEGF-NLC administradas dos veces por semana de forma tópica, no solo aumentara la velocidad de cierre de la herida comparándolo con el mismo número de administraciones intralesionals de 75 ¿g de rhEGF libre, sino que también mejoraron la calidad de la cicatrización.- Las nanopartículas lípidicas cargadas con rhEGF son sistemas de liberación apropiados para el tratamiento local de heridas crónicas porque, independientemente del tipo de apósito-sistema de liberación integrado que se ha preparado, se mantienen en la superficie de la piel durante al menos 48 h y actúan como un reservorio para la liberación sostenida del rhEGF.