Food bioactive compounds effectiveness on zebrafish lipid metabolism

Resumen

El sobrepeso y la obesidad se han convertido en una pandemia global que en muchos países afecta a más del 60 % de la población. Ambos suponen un incremento en el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, diabetes y algunos tipos de cáncer, y por ello, la reducción de su incidencia se ha convertido en una prioridad para instituciones y organismos de salud. La industria alimentaria también juega un papel importante en este proceso, diseñando productos saludables, asequibles y convenientes para toda la población.Dentro de estos productos se encuentran los alimentos funcionales. Éstos pueden poseer, o se les añaden, compuestos con propiedades beneficiosas para la salud. Los alimentos funcionales con habilidad para regular el metabolismo lipídico, desequilibrado en el sobrepeso o la obesidad, podrían ayudar en la reducción de la incidencia de estas dolencias, y por tanto, existe un gran interés en su desarrollo.La mayor dificultad para la industria de los alimentos funcionales es, precisamente, la determinación de la efectividad de los compuestos activos. Antes de los ensayos en roedores, pueden realizarse ensayos in vitro y/o en animales inferiores, con el ánimo de afinar y reducir los estudios posteriores. Estos estudios pueden reducir el número de compuestos a testar y ofrecen información relevante para un mejor diseño experimental posterior.El pez cebra (Danio rerio) tiene gran similitud con los mamíferos a nivel molecular, celular, tisular y de sistemas. Su pequeño tamaño, su rápido crecimiento y su elevada tasa de fecundidad, entre otras, lo convierten en un modelo con grandes ventajas metodológicas y de reducido coste. Además, el uso del pez en su fase embrionaria es considerado alternativo a la experimentación animal. Por todo ello, se ha popularizado en los últimos años y ha pasado de ser un modelo usado en desarrollo y toxicidad, a ser un modelo animal habitual en otros campos como en neurociencias, cáncer o inmunología, y más recientemente en investigación alimentaria. Asimismo se ha usado para mimetizar alteraciones del metabolismo lipídico y sus consecuencias.Basándonos en las metodologías disponibles y el interés de la industria alimentaria en identificar nuevos compuestos, se planteó como objetivo de la presente Tesis doctoral la evaluación de la efectividad de compuestos bioactivos en el metabolismo lipídico del pez cebra. Para ello se evaluaron y optimizaron diversas metodologías descritas para ese modeloanimal y en su validación se empleó el resveratrol, un conocido modulador del metabolismo lipídico.En primer lugar se optimizaron varias metodologías en la fase embrionaria, entre el momento de la eclosión del huevo (48-72 h tras la fecundación) y hasta el quinto día, momento en el que el embrión empieza a alimentarse externamente. En esta fase los embriones dependen de su reserva grasa, el vitelo, y son transparentes, lo que supone ventajas adicionales. De hecho, el marcado de la grasa in vivo con una tinción lipofílica fluorescente permitió visualizar el vitelo. Inicialmente se optimizó el protocolo de tinción y posteriormente se testó el resveratrol. Este polifenol indujo una fuerte reducción en la fluorescencia del vitelo, lo que reflejó su habilidad para incrementar el consumo de la reserva grasa. Se creó un protocolo para la medida de la fluorescencia y se optimizó la exposición al resveratrol, y fue posible cuantificar una reducción significativa de hasta el 80 % del vitelo.Para comprender mejor la fuerte reducción de grasa observada, se estudió la expresión de genes clave del metabolismo lipídico, involucrados en la lipólisis, lipogénesis, o el transporte de lípidos y reguladores transcripcionales. Se seleccionaron genes con conocida homología con los humanos y se diseñaron los primers a partir de las secuencias de las bases de datos (NCBI y ensemble). El resveratrol indujo pequeños cambios pero significativos en algunos de estos genes, y algunos aparentemente contradictorios, ya que sugerían el aumento simultáneo de la lipogénesis y la lipólisis. Sin embargo, este efecto puede deberse a que se analizó la expresión en homogenados de embriones, donde pueden confundirse mecanismos de compensación o diversas respuestas en diferentes tejidos. En cualquier caso, la presencia de cambios significativos en estos genes clave refleja el efecto que el resveratrol tiene sobre el metabolismo lipídico a nivel transcripcional.Por otro lado, el estudio de la tasa metabólica resulta de interés para aumentar el conocimiento sobre el mecanismo de acción de compuestos activos en el metabolismo lipídico, por lo que se optimizó su cuantificación. Con el uso de un indicador de pH en el medio se observó la acidificación del medio como consecuencia de la respiración a lo largo de 1 h. Embriones expuestos a dinitrofenol (DNP), un inductor del metabolismo, incrementaron la tasa metabólica respecto el control. Similarmente, los embriones expuestos a resveratrol durante 24 h también presentaron un aumento en la tasa. El incremento observado en la respiración se corresponde bien con la habilidad del resveratrol de incrementar el número de mitocondrias y su actividad, y explica, al menos en parte, el aumento del consumo de la reserva grasa.A continuación, se seleccionaron metodologías en la fase larvaria del pez cebra, donde es posible analizar nuevos parámetros y efectividades así como estudiar el efecto de dietas de diferente composición. Se registró la supervivencia y el crecimiento de larvas alimentadas con dieta estándar y dieta rica en grasa, pero no se observaron diferencias en los primeros 2 meses de crecimiento, por lo que se buscaron metodologías alternativas.El marcado con una tinción lipofílica permitiría observar los adipocitos ya desarrollados y estudiar el efecto de diferentes compuestos sobre éstos (test obesogénico). Sin embargo, la opacidad del tejido de las larvas (cada vez mayor por su creciente tamaño) y la presencia de pigmentos imposibilitó la toma de medidas precisas, por lo que se desestimó el uso de esta metodología.Por otra parte, se estudió la acumulación de lípidos en las arterias de las larvas después de ser alimentadas con dietas enriquecidas en colesterol, como indicador de inicio de aterosclerosis. No obstante, a pesar de que el contenido de colesterol de las larvas aumentó, no fue posible observar los depósitos, por lo que no pudo implementarse este método.En resumen, en los ensayos en fase larvaria se identificaron varias metodologías de especial interés por su corto tiempo de aplicación. Sin embargo, aún requieren ser optimizadas. Además, se pudo observar una degradación del resveratrol en presencia de la dieta, lo que indica que los ensayos en esta fase requieren de medidas de encapsulación o protección, innecesarias en los ensayos en la fase embrionaria. Por todo ello, se seleccionaron los ensayos en fase embrionaria para la determinación de la efectividad de diferentes compuestos bioactivos.Así pues, se testaron diferentes dosis de resveratrol y piceid, así como diferentes tiempos de exposición y se cuantificó su habilidad para incrementar el consumo de la reserva grasa. Ambos compuestos presentaron un efecto dosis y tiempo dependientes siendo el resveratrol, el que mostró un efecto más temprano y a su vez una aparente saturación del efecto en la exposición más larga. Asimismo se estudió la metabolización de dosis efectivas de ambos compuestos a lo largo del tiempo mediante la detección de estos compuestos, en el medio y los embriones, por cromatografía líquida acoplada a un detector de masas. Se pudo comprobar que las rutas de metabolización principales del piceid y resveratrol en los embriones, la glucuronidación y sulfatación, son las mismas a las descritas en mamíferos. Estos resultados validan el uso del pez cebra para testar efectividad en el metabolismo lipídico para este grupo de moléculas, ya que metaboliza los polifenoles en un modo similar a otros modelos.A continuación, se testaron extractos polifenólicos de subproductos de la industria alimentaria. Se realizó en primer lugar la extracción de los polifenoles de varios subproductos de vegetales, cítricos y vino, y se midió su capacidad antioxidante y contenido total de polifenoles. Los extractos obtenidos a partir de subproductos de alcachofa, limón y vino (lías) obtuvieron los valores más altos y se estudió su composición polifenólica. Simultáneamente se determinó la habilidad estos tres extractos para inducir el consumo del vitelo del embrión del pez cebra, y se vio que los test in vitro no fueron buenos predictores del efecto in vivo y que el extracto de lías indujo la mayor reducción de grasa (más de un 40 %). El extracto de lías fue consecuentemente seleccionado y su efecto reductor de grasa se estudió a distintas dosis y exposiciones, así como su efecto en la expresión génica y en la tasa metabólica. La dosis no toxica más alta mostró el mayor efecto, y de nuevo, dependiente del tiempo de exposición. La dosis efectiva indujo pequeños cambios en la expresión de genes, y se vio una inducción de las rutas lipogénicas y lipolíticas, como ocurrió con el resveratrol. La tasa metabólica sin embargo no sufrió cambios, lo que sugiere que la inducción del consumo de la grasa puede deberse a otros mecanismos. En conjunto, estos resultados muestran que los subproductos de la industria alimentaria son una fuente importante de polifenoles con efectividad sobre el metabolismo lipídico, lo que aumenta su valor añadido.Finalmente se estudió el perfil lipídico de los embriones para considerar su uso como indicador de efectividad. El procedimiento de recogida de los embriones y su procesado tuvo un importante impacto en las clases de lípidos detectados y en el consiguiente perfil de la fracción de los fosfolípidos. Tras minimizar la posible degradación de las muestras con un estricto control de la temperatura de la recogida, una extracción inmediata y el uso de inhibidores enzimáticos, se estudió el perfil de ácidos grasos de las fracciones de triglicéridos (TG) y fosfolípidos (FL). Tal y como otros autores han descrito, el pez cebra tanto en la fracción de TG como en los FL, se componen mayoritariamente de ácidos grasos poliinsaturados, en segundo lugar de saturados y en menor medida de monoinsaturados. Un hito interesante fue detectar grasas trans en los embriones, por lo que se analizaron las dietas para intentar averiguar el origen. Efectivamente, todas las dietas analizadas contenían grasas trans en diferentes proporciones. Por otro lado, se estudió el efecto de la exposición al resveratrol y al extracto de lías en el perfil de ácidos grasos, y se encontraron pequeños pero interesantes cambios. Se observó un incremento de un poliinsaturado de larga cadena (EPA) y se observaron pequeños aumentos en el ácido esteárico y oleico, los primeros ácidos grasos generados en la síntesis de novo endógena lo que corresponde con la inducción de la lipólisis observada en los cambios de la expresión génica. Las lías y el resveratrol indujeron tambiénuna reducción de las grasas trans, lo que se puede deber a la inhibición de su formación endógena como consecuencia del estrés oxidativo, ya que ambos compuestos son potentes antioxidantes. Por todo ello, el perfil lipídico podría considerarse una potencial metodología para estudiar el efecto de compuestos bioactivos en el perfil lipídico.En definitiva, el pez cebra es un modelo válido para testar el efecto de compuestos y extractos polifenólicos (y potencialmente moléculas de otra naturaleza) ya que metaboliza estos compuestos y es posible detectar alteraciones en su metabolismo lipídico de un modo rápido y económico.