Regulación de la actividad de factores de transcripción por proteínas de la familia ubiquitina

Resumen

Las proteínas están reguladas en su gran mayoría por una variedad de modificaciones post-traduccionales con capacidad de cambiar sus propiedades y funciones. La ubiquitinación es una de las modificaciones post-traduccionales mas estudiadas debido a su estrecha relación con la degradación de proteínas a través del proteasoma. La interacción de ubiquitina con otros miembros de la familia la ubiquitina (por ejemplo, SUMO) y otras modificaciones post-traduccionales, aumenta la complejidad y la plasticidad de los mecanismos moleculares regulados por ubiquitinación 1 2 3 4. Cualquier disfunción en estos sistemas puede conducir a desregulaciones en la célula favoreciendo la aparición de patologías, como el cáncer, la inflamación o la neurodegeneración, entre otros 5 6 7 6. En particular, las proteínas ubiquitina y SUMO regulan factores celulares esenciales, tales como el inhibidor de la vía de NF-B, IB; las proteínas supresoras de tumores de p53 y PTEN o la proteína de la leucemia promielocítica, PML 5 1 8 9. El estudio de dichos mecanismos de regulación es necesario para comprender mejor el orígen de las patologías asociadas e identificar posibles biomarcadores o dianas terapéuticas. Por lo tanto, el desarrollo y uso de herramientas adecuadas para comprender mejor estos sistemas de modificación de proteínas son clave en el progreso de éste campo de investigación. El estudio y la identificación de sustratos modificados por ubiquitina y SUMO se ha logrado, en su mayoría, mediante el uso de formas etiquetadas de estos modificadores y de sus sustratos, que son posteriormente purificados utilizando cromatografía de afinidad. El uso de este método fue y sigue siendo una de las maneras más utilizadas para obtener información sobre el papel de estos modificadores y en el control de la función y la estabilidad de las proteínas que modifican. Sin embargo, en muchos casos, esta estrategia depende del uso de métodos de sobre expresión que alteran el equilibrio natural de estas moléculas, dando lugar a la generación de artefactos. De esta manera, el desarrollo o la mejora de métodos que permiten la purificación de proteínas endógenas modificadas por ubiquitina y SUMO, a partir de diferentes líneas de células, tejidos u órganos, es sin duda un paso fundamental para obtener información más legítima y más cercana a la fisiología de la célula 10 11 12. Por tanto, el objetivo principal de éste proyecto es comprender el papel de la ubiquitina y SUMO en el control de la actividad y/o estabilidad de algunos factores importantes para la célula utilizando niveles endógenos. En general, la purificación y enriquecimiento de substratos modificados por ubiquitina y SUMO se ve obstaculizada por su inestabilidad inherente, derivada tanto de la degradación proteasomal, como de la hiperactividad de las enzimas de des-modificación 13 14. En este trabajo, se utilizaron trampas de ubiquitina (también conocidas como TUBEs) para estudiar y capturar la proteína IB ubiquitinada a partir de células tratadas o no con TNF 15 16. Esto permitió demostrar la existencia de una forma mono-ubiquitinada de IB a partir de células no estimuladas y de tejidos de ratón. La unión covalente de una sola molécula de ubiquitina en IB no permite que otras proteínas reguladoras como IKKß y ßTrCP puedan interaccionar con IB, afectando negativamente la actividad de NF-B 17. Basándonos en el conocimiento existente de secuencias de aminoácidos que interactúan con moléculas de SUMO, designadas como SIMs, como aquellas presentes en la ligasa de ubiquitina dependiente de SUMO, RNF4, se desarrollaron sistemas de captura (trampas) capaces purificar proteínas modificadas por SUMO 18 19. La versión larga de las trampas de SUMO contiene 8 SIMs y se ha demostrado que es capaz de capturar formas SUMOiladas de IB, PML, p53 o PTEN a partir de ensayos de modificación in vitro y/o de cultivos celulares (in vivo) 20. Aunque estas trampas están predispuestas a interactuar con cadenas de poli-SUMO-2/-3, algunas formas conjugadas con SUMO-1 de los diferentes sustratos también han sido capturadas en ensayos in vitro. Finalmente, para intentar identificar sitios endógenos de modificación de SUMO-2/-3 mediante espectrometría de masas, se utilizó un anticuerpo monoclonal contra SUMO-2/-3 como columna de afinidad para capturar péptidos ramificados de SUMO-2/-3, a partir de células estresadas por choque térmico. Después de la inmuno- selección, estos péptidos se digirieron para generar y enriquecer péptidos más cortos y así permitir un mejor análisis por espectrometría de masas 10. Los resultados preliminares indican que esta técnica funciona y hasta ahora se han identificado alrededor de cien sitios de SUMOilación endógenos. Dicho numero de sitios es el número actual de sitios conocidos y publicados en la literatura por varios laboratorios de investigación especializados. Esto indica que con una mejor optimización, el protocolo aquí descrito puede, ser mejorado y lograr aumentar nuestro conocimiento sobre los sitios endógenos de SUMOilación y de las funciones celulares que regulan. En su conjunto, los datos presentados en este documento sugieren la existencia de diversas formas de regulación de factores celulares esenciales modificados por ubiquitina y por SUMO. También proporciona alternativas metodológicas para el estudio de procesos regulados por éstos miembros de la familia ubiquitina a nivel endógeno.