Molecular and functional study on exosome-like vesicles as a new source of non-invasive biomarkers for liver disease

Resumen

Los exosomas son vesículas con un diámetro comprendido entre los 30 y 100 nm de origen endocítico que se forman a partir de la membrana limitante de los cuerpos multivesiculares. La secreción de exosomas ha sido demostrada en numerosos y diversos tipos celulares así como su presencia en diferentes fluidos biológicos, como por ejemplo la sangre o la orina. Los exosomas fueron descritos por primera vez como un mecanismo celular para el desecho de proteínas durante el proceso de diferenciación de los reticulocitos. Diez años más tarde se demostró la presencia de moléculas MHC en exosomas y su participación en procesos inmunológicos, desde entonces se han atribuido a los exosomas varias funciones en comunicación intercelular. El análisis proteómico de estas vesículas ha permitido determinar que contienen tanto proteínas comunes a todos los exosomas como proteínas específicas del tipo celular que las secreta. Cabe destacar que la composición de los exosomas varia dependiendo del estímulo al que se someta la célula que los secreta. Es por ello que los exosomas que se encuentran en los fluidos biológicos son utilizados como una fuente para el descubrimiento de nuevos marcadores biológicos de enfermedades. En este estudio se han caracterizado a nivel bioquímico y estructural vesículas con características distintivas de exosomas secretadas por dos líneas celulares hepáticas no tumorales y por cultivos primarios de hepatocitos de rata. Utilizando una tecnología que ha sido descrita recientemente y que se llama exosome display technology, hemos aprovechado el marcador exosomal CD63 para dirigir la secreción específica de proteínas en asociación con exosomas, demostrando su posterior funcionalidad. El análisis proteómico de exosomas secretados por células MLP-29 y hepatocitos de rata primarios ha determinado una particular composición proteica en este tipo de exosomas. Cabe destacar la presencia en exosomas derivados de hepatocitos de rata de diversas enzimas implicadas en el metabolismo de compuestos xenobióticos. En concreto hemos observado un especial enrequicimiento del citocromo P450 2D1 en estos exosomas. Por otra parte, anomalías a nivel endocítico son comunes durante el desarrollo de la enfermedad del cáncer. Por esta razón hemos estudiado la composición proteica de exosomas secretados por cultivos primarios de hepatocitos obtenidos a partir del hígado de ratones portadores de una delecion del gen MAT1A y GNMT, los cuales desarrollan espontáneamente esteatosis, esteatohepatitis y carcinoma hepatocelular. Como resultado hemos observado cambios en la expresión de TfR y Lamp1 a nivel de exosomas en hepatocitos aislados a partir de ratones knockout MAT1A-/- y GNMT-/-, respectivamente. Asimismo, mostramos el uso de los exosomas derivados de cultivos primarios de hepatocitos de rata como un material útil para la búsqueda de marcadores de enfermedades hepáticas. En este sentido, hemos determinado mediante el uso de proteómica cuantitativa libre de etiquetas cambios en la expresión de proteínas de estos exosomas tras el tratamiento de hepatocitos de rata primarios con dos toxinas hepáticas diferentes, como son la D-galactosamina y el lipopolisacárido. El tratamiento de hepatocitos de rata con D-galactosamina resulta en la inducción de la expressión de citocromo P450 2D1 en asociación con exosomas. De acuerdo con esta observación, la administración de D-galactosamina a ratas derivó en la inducción de los niveles de citocromo P450 2D1 en exosomas del suero. Notablemente, los niveles de citocromo P450 2D1 en el suero de ratas tratadas con D-galactosamina correlacionan con el daño hepático inducido. Por lo tanto, hemos propuesto el uso de este marcador como un indicador de daño hepático. Por último, hemos caracterizado los exosomas contenidos en la orina de rata para la búsqueda de marcadores biológicos no invasivos de enfermedades del hígado. El análisis proteómico de estos exosomas ha demosrtado la presencia de varias proteínas relacionadas con distintas enfermedades. Por otra parte, la composición proteica de los exosomas de la orina de ratas tratadas con D-galactosamina estaba severamente afectada indicando que los exosomas de orina son una valiosa fuente para la búsqueda de nuevos biomarcadores. Además, el análisis de los exosomas de la orina de los ratones knockout GNMT-/- nos ha llevado a proponer CD10 como un posible marcador temprano de carcinoma hepatocelular.