Mechanisms behind the assembly and stabilization of hyaluronan-rich extracellular matrices

Resumen

Muchas células eucariotas se rodean de una matriz rica en polisacáridos similar a un hidrogel. Un ejemplo de estas matrices pericelulares es la matriz del cumulus-oophorus (COC), un recubrimiento viscoelastico y extendido que crece alrededor del ovocito solo antes de la ovulación y que se requiere para la fertilización. Un componente crucial de estos recubrimientos es acido hialurónico (AH). El AH es un polisacárido linear, posee una estructura simple que se ha preservado durante la evolución. Sus unidades repetitivas son disacáridos de acido glucurónico y N-acetilglucosamina. El número de unidades repetitivitas de disacárido puede llegar hasta 10000 o más, con un peso molecular alto (105-107 Da). La longitud de un disacárido es de aproximadamente 1 nm, por tanto la cadena entera de AH puede llegar a extenderse varios micrómetros ~ 10 ¿m si la molécula esta extendida de extremo a extremo. Desde el punto de vista de la física de polímeros, el AH está descrito como un polielectrolito. En solución, el AH adopta una conformación hidratada y enrollada al azar. Los polímeros de AH de tamaño típico, el contenido de agua de dicha conformación está en torno al 99.9%. La cadena de AH es muy larga y por tanto puede albergar cientos de ligandos para las hialadherinas. Las capas también tienen proteínas con ligandos para el AH que participan en el auto organización de el recubrimiento grueso, suave y hidratado. El TSG-6 (factor estimulador de necrosis tumoral gen 6), el inter-¿ -inhibidor, (I¿I) y la pentraxina 3 (PTX3) son proteínas que han demostrado ser muy relevantes para estabilización de la matriz COC, pero el cómo forman una matriz estable y funcional todavía permanece poco entendido. TSG-6 es una proteína multifuncional que se expresa bajo condiciones inflamatorias y por las células cumulus en el folículo preovulatorio. Tiene muchos ligandos, entre los cuales se encuentran el AH, I¿I y PTX3. El TSG-6 está compuesto de dos dominios: el módulo Link tiene capacidad interaccionar con el AH y el módulo CUB. El módulo Link en algunos casos tiene efectos biológicos comparables con la proteína entera. Inter-¿-inhibidor es un complejo proteoglicano constitutivo de la sangre; consiste en dos cadenas pesadas HC1 y HC2 covalentemente ligadas via condroitín sulfato a otra subunidad ligera la bikunina. Las interacciones entre el I¿I, el TSG-6 y el AH llevan a la formación de complejos covalentes HA¿HCs. La modificación covalente de la matriz COC con las HCs tiene una consecuencia particular en la formación de la matriz ¿ los ratones que no producen bikunina (que no pueden producir I¿I) son incapaces de formar una matriz estable. Sin embargo, la presencia de TSG-6, I¿I es no suficiente para estabilización de la matriz COC, porque los ratones que no producen PTX3 mostraron inestabilidad de la matriz y falta de fertilidad. PTX3, el receptor reconocedor de patrones soluble pentraxina 3, es un miembro de la familia de la pentraxina. La proteína la forma un complejo de 8 subunidades idénticas (PM ~42.5 kDa) estabilizadas por enlaces disulfuro. Cada protómero de PTX3 consiste de un dominio C-terminal de tipo pentraxina, homólogo a la clásica pentraxina corta y un dominio N-terminal único. Las células cumulula s de los ratones con PTX3-/- son incapaces de organizar una matriz funcional. La adición exógena de PTX3 recupera la formación de la matriz COC. Aunque PTX3 no interacciona con el AH, existe la hipótesis que su incorporación en la matriz-AH esta mediada por el dominio Link del TSG-6 o HCs unidos covalentemente al AH. Es más, los datos in vivo sugieren la importancia de la regulación espacio-temporal en la organización de la matriz COC. En particular, se ha establecido que las expresiones de TSG-6, PTX3 y AH tienen perfiles temporales similares. El TSG-6 se ha encontrado co-localizado con el AH a lo largo de la matriz desde la periferia de las celulas cumulus a la zona pelúcida. El I¿I es un cosntitutivo de la sangre y penetra el folículo tras la activación hormonal de la oculación, cuando la barrera de permeabilidad se vuelve permeable, y con el tiempo se difunde hacia el ovocito. Tras 6 horas de inducción de la ovulación se retiene un gradiente de PTX3 en la matriz COC. Dicha organización espacio-temporal puede ser crucial para la regulación de la interacción AH/proteína y el correcto autoorganización de la matriz COC. El objetivo de esta tesis ha sido adquirir conocimiento sobre los procesos de auto ensamblaje supramolecular que conducen a la formación de matrices ricas en AH para saber cómo se estabilizan dichas matrices y para relacionar las propiedades físico-químicas de las matrices con sus funciones biológicas. Para este propósito utilizamos un sistema-modelo bien definido y simplificado de capas pericelulares: películas de AH, donde el polymero esta unido a superficie en uno de sus extremos. Las películas de AH se crearon sobre soportes sólidos, permitiendo la aplicación de técnicas de superficie como quartz cristal microbalance (QCM-D), elipsometría espectroscópica (SE) y reflection interference contrast microscopy (RICM) para caracterizarlas en detalle y permitiendo la realización de experimentos cuantitativos altamente controlados. Ha sido necesario desarrollar diferentes metodologías en el diseño y manipulación de las películas de AH necesarias para la tesis. En particular, el AH polimérico puede ser reemplazado por AH oligomérico, permitiendo así controlar el número de puntos de enlace por cadena de AH. Al cambiar entre plataformas de OEG y SLB los puntos de anclaje pueden mantenerse, potencialmente, bien lateralmente móviles o bien inmovilizados. Los modelos basados tanto en OEG como en SLB fueron notablemente resistentes al tratamiento con GuHCl. Por último, establecimos un protocolo para la desecación/rehidratación de películas de AH basadas en OEG sin que su comportamiento fuera afectado de forma significativa, facilitando así el uso de películas de AH fuera del laboratorio en el que han sido producidas. Estas modificaciones demuestran que las propiedades de las películas de AH se pueden ajustar a las aplicaciones deseadas. Las matrices de AH crecientemente complejas fueron reconstituidas por adición externa de proteínas a las capas de AH, proteínas que se sabe que están involucradas en el ensamblaje y estabilización de las matrices. Los datos cuantitativos del sistema modelo demuestran que TSG-6 forma oligómeros al interaccionar con AH que actúan como reticulantes efectivos de AH. En concentraciones que podrían ser fisiológicamente relevantes, TSG-6 es capaz de transformar las capas de Ah de un estado altamente expandido en una capa condensada y bastante rígida. Este tipo de remodelación podría ocurrir en el glicocálix endotelial y hacer la función de señal primaria para atraer a los leucocitos. La remodelación de la matriz extracelular de los TSG-6 podría afectar también a las propiedades mecánicas de las células y cambiar significativamente su fenotipo. En la artritis la retención de AH por la reticulación con del TSG-6 en la capa de los condrocitos podría contribuir a su función condroprotectora. I¿I dicta la actividad de TSG-6 y remodela las propiedades de la matriz de AH. La reticulación y compactación inducida por TSG-6 de las películas de AH se ve inhibida por la presencia de I¿I. Esto lleva a la inhibición del enlace de AH con las células positivas en CD44 mediado por TSG-6. Una incubación prolongada con TSG-6 y I¿I resulta en películas de AH que contienen, además de HCs enlazadas covalentemente a AH, varias especies moleculares que están firmemente pero no covalentemente enlazadas. El material no covalentemente enlazado, que incluía TSG-6, tiene la habilidad de transferir HCs a AH. También demostramos que la interacción entre las proteínas TSG-6, I¿I y PTX3 determina las propiedades estructurales y morfológicas de la matriz de AH. PTX3 era inerte a la interacción con una matriz de AH que fuera resultante de la interacción ternaria entre I¿I, TSG-6 y AH, a pesar de que dichas matrices contienen el complejo HA¿HC; se ha sugerido que dichos complejos son potencialmente ligantes de PTX3. Además, PTX3 no puede ser introducido en una matriz de AH únicamente mediante TSG-6. Al contrario, observamos que la interacción de PTX3 con I¿I y TSG6 antes de encontrarse con AH es necesaria para que pueda incorporarse eficientemente a la matriz. PTX3 parece estar involucrado en la reticulación. A pesar de haber incorporado con éxito todas las proteínas que se han visto que son cruciales para la estabilidad de las matrices de COC en las capas de AH, todavía no se conoce la estructura exacta de los nódulos de reticulación en la matriz de AH. Próximos estudios con dominios seleccionados de proteínas (en particular HCs recombinantes) o formas mutantes (por ejemplo PTX3 que forme dímeros o tetrámeros), utilizando las pruebas desarrolladas en esta tesis, deberían permitir esclarecer aún más esta cuestión. Basados en los hallazgos enumerados arriba, postulamos que hay una interacción funcional entre los diferentes mecanismos reticulantes en el ensamblaje de la matriz de COC. En particular, la reticulación inducida por TSG-6 podría ser importante en las primeras fases de ensamblaje de la matriz de COC, cuando la síntesis de AH y TSG-6 es elevada. TSG-6 podría ayudar a retener en la matriz del cúmulo de células el exceso de AH producido antes de que la pared de folículos se haga permeable a otro ligante de TSG-6 ¿ I¿I. Cuando I¿I entra en el folículo, la reticulación de TSG6 se vería perjudicada. Para estabilizar la estructura en su totalidad, PTX3 se incorpora a la matriz de AH en las regiones donde las proteínas (o sus subunidades) se topan. Esto llevaría a la formación de estructuras reticuladas que son transitorias y por tanto permiten la incorporación de nuevas cadenas de AH y, en última instancia, la expansión de la matriz de COC. En el futuro esta hipótesis podrá ser verificada en sistemas modelo tridimensionales (3D). Con este fin, microesferas recubiertas de AH podrían ser incrustadas a una matriz de AH por medio de la adición externa de proteínas y AH. Las propiedades mecánicas de las matrices artificiales que tengan composiciones diferentes se pueden comprobar y comparar a las de una matriz de COC real. La reconstitución de un material 3D extenso debería brindar una valiosa prueba si AH, TSG-6, I¿I y PTX3 juntos pudieran, de hecho, componer el sistema mínimo requerido para el ensamblaje, expansión y estabilización de la matriz de COC.