Tobacco mosaic virus (tmv) as a nanoscaffold for inorganic assemblies

Resumen

Las plantillas artificiales pueden ser sintetizadas por un buen número de técnicas tales como litografía (UV o de haz de electrones), formación de micelas, deposición de haz de iones, síntesis química en disolución, etc. Sin embargo las nanoestructuras artificiales no poseen al 100% la misma distribución de tamaños y formas, y a menudo presentan defectos. En nanofabricación las bioplantillas son preferidas a los materiales compuestos artificiales, ya que las moléculas biológicas mantienen de manera perfecta su tamaño, forma y composición química. Esto nos llevó a buscar bioplantillas que pudieran ser usadas para nanofabricación en nanotecnología. El virus del mosaico del tabaco (VMT) es un virus ARN de forma cilíndrica que provoca enfermedades en el tabaco y en otras plantas. Posee una longitud de 300 nm y un diámetro de 18 nm. Se trata de un tubo de proteínas muy estable que posee un canal interno de 4 nm de diámetro. El VMT se alinea a menudo en oligómeros de 600 nm, 900 nm ó 1200 nm de longitud. Su superficie externa es altamente polar y contiene grupos OH y COOH, estos últimos mayoritariamente deprotonados. Una partícula única de VMT contiene 2130 proteínas de cubierta idénticas. Las subunidades de proteína de cubierta se autoensamblan en una estructura helicoidal de tubo, de tal forma que el ARN se encuentra alojado en su interior. El VMT es estable en un amplio rango de valores de pH (<3 a >8.5) y de temperaturas (>80ºC). Todas estas propiedades físicas del VMT hacen de él un fantástico andamio biológico/proteico en un gran número de estrategias y técnicas de nanoescala. Nosotros usamos el VMT como nanoandamio (bioplantilla) para la deposición de materiales inorgánicos como metales (Ni y Au) y óxidos metálicos (óxido de hierro) en el exterior del tubo de proteína y complejos metálicos (cisplatino y oxaliplatino) dentro del canal de 4 nm. En primer lugar demostramos que el VMT puede ser empleado para la deposición metálica. El níquel metal ha sido depositado en el exterior del tubo de proteína del VMT. A temperatura ambiente el Ni se comporta como un ferroimán. El objetivo había sido la metalización de los tubos de VMT al completo o sólo en los extremos. Los tubos de VMT metalizados con Ni serían capaces de inducir hipertermia y podrían ser también usados como ferrofluidos. El VMT ha sido metalizado en suspensiones acuosas formando depósitos únicos en forma de mancuernas, de varillas o de tubos, con diámetros de hasta 3 nm y longitudes de varios micrómetros. El proceso de recubrimiento está basado en la adsorción de cationes de metales nobles seguido de una deposición autocatalítica no electrolítica (ELD). El proceso ELD de Ni en el VMT progresa a través del crecimiento de relativamente pocos núcleos aislados localizados en clusters de Pd. Añadiendo el surfactante aniónico Re610/E se produce la deposición de puntos de Ni, sólo en los extremos del VMT. De manera similar el uso de un surfactante no iónico, Igepal, resulta en el crecimiento de de partículas de Ni densamente espaciadas sobre el VMT. Las medidas de magnetometría realizadas en estas muestras de VMT (metalizadas con Ni) encuentran una magnetización de saturación de aproximadamente 0.004 emu por gramo de depósito sólido (que contiene Ni VMT, pero también sales procedentes del baño). Este valor tan pequeño puede explicarse por la formación de una microestructura cluster consistente en núcleos de Ni bastante pequeños y rodeados por un capazón de NiO, que podría ser indicativo de una oxidación extensiva. Sin embargo, la medida de coercividad de 90 Oe es similar a la del Ni masivo (100 Oe), sugiriendo que los núcleos son suficientemente grandes como para mostrar ferromagnetismo masivo. En segundo lugar, empleamos el VMT como bioplantillas para la síntesis de nanotubos de óxido de hierro. Mientras que las síntesis de nanopartículas y nanovarillas de óxidos de hierro se encuentran bien establecidas, los nanotubos son por ahora objetos raros pero con interesantes propiedades magnéticas específicas. Los nanotubos podrían reemplazar a las usuales nanopartículas esféricas en aplicaciones médicas, especialmente imagen por resonancia magnética e hipertermia terapéutica. Los óxidos de hierro son aquí de gran importancia debido a su combinación única de inocuidad (no toxicidad) y magnetismo (ferro-, ferri-, superparamagnetismo). La Figura 1. (a) Imagen de SEM de una red de VMT (varillas negras) metalizadas con Ni (esferas blancas) y (b) Magnetización como función del campo aplicado de VMTs metalizados con Ni. síntesis del óxido de hierro sobre VMT supone una química sencilla en disolución y con condiciones suaves. La mezcla de Fe2+ acuoso y sales de Fe3+ fue empleada para formar óxido de hierro en la superficie externa del VMT cubierta de grupos carboxilato. La visualización por microscopía electrónica de barrido muestra virus de plantas cubiertos por una capa fina de óxido de hierro (5-7nm). La microscopía de transmisión electrónica muestra que la síntesis no destruye el virus, e incluso con el recubrimiento de óxido de hierro se pudo ver intacto. El análisis local de EDX demostró la presencia de hierro en la superficie externa de la proteína, que tiene que estar en la forma de óxido de hierro. Sin embargo, el análisis de difracción de rayos X (XRD) no mostró señales que pudieran corresponder a algún tipo de óxido de hierro. Por lo tanto se concluyó que el recubrimiento de óxido de hierro en la superficie externa del VMT es predominantemente amorfo. Las partículas mineralizadas de virus de plantas fueron también examinadas en un SQUID-VSM a 300 K debido a sus propiedades magnéticas. El momento magnético del VMT mineralizado posee una saturación de magnetización de 0.00082 emu/g compatible con un óxido de hierro no cristalino. A pesar de ello, el elevado valor de coercitividad de 0.04 T es inusual. Esto es debido a la naturaleza ferrimagnética del óxido y de la estructura tubular de nuestros nanotubos de óxido de hierro. Las estructuras amorfas a menudo se transforman en fases cristalinas tras un tratamiento térmico. Nuestras muestras no mostraron cambios de tamaño o forma tras el calentamiento, per el tratamiento térmico en aire (a 520 K) y en vacío (a 570 K) produjeron la(s) fase(s) cristalina(s) esperada(s) de ¿-Fe2O3 y Fe3O4, independientemente de que fueran analizadas después del calentamiento en aire o en vacío. A parte de estos cambios a escala atómica, observamos un enorme incremento en el momento magnético. La magnetización de saturación se incrementó a >1 emu/g, mientras que la coercividad se redujo a ¿0.001 T. Los valores se ajustan ahora con precisión a típicos ¿-Fe2O3 y Fe3O4 cristalinos y de nanoescala. Nuestros tubos recocidos de VMT mineralizados pudieron ser usados en ferrofluidos, donde su forma induciría mucho mayor viscosidad que las partículas normales. En tercer lugar, presentamos la unión de elevado rendimiento de nanopartículas de Au cubiertas con citrato (6 nm) a los residuos de la proteínas externas del VMT de tipo salvaje (natural) a través de un método simple en condiciones ambiente. Las nanopartículas de Au poseen propiedades químicas, ópticas, eléctricas y catalíticas únicas y por lo tanto han sido estudiadas más extensivamente. Se emplean para un gran número de aplicaciones tales como immunoensayos de biosensores, visualización óptica y fototermolisis de células cancerosas. Las nanopartículas de Au se encuentran normalmente cubiertas con agentes como el citrato para estabilizar la superficie. El recubrimiento con citrato puede ser ocupado por un número de grupos químicos que dejan la superficie de Au disponible para la funcionalización con DNA, péptidos, anticuerpos, etc. La unión de Au a varillas de VMT ya ha sido investigada por otros grupos con VMT mutados, conteniendo cisteína, o a través de complejos protocolos de síntesis. Nosotros desarrollamos un método de preparación nuevo, simple y fácil que no requiere mutantes de VMT. Un hecho interesante de esta síntesis es que produce la decoración satisfactoria de VMT con nanopartículas de Au, sólo a valores de pH bajos, i.e. 2.9-3.4, cerca del punto isoeléctrico del VMT de 2.8. Las partículas de VMT fueron incubadas con nanopartículas de Au cubiertas con citrato en una solución acuosa de ácido cítrico. La síntesis condujo a la decoración de VMT a lo largo de toda su longitud con nanopartículas de Au. Las medidas de potencial Z muestran que en el régimen de pH de la decoración de VMT, las varillas virales están cargadas positivamente, mientras que las nanopartículas de Au cubiertas con citrato están cargadas negativamente. Así pues decoramos las varillas de VMT con nanopartículas de Au negativamente cargadas, explotando la protonación de los residuos aminoácido acídicos en el TMV, obteniendo un exterior positivamente cargado. Esta aproximación para la decoración de VMT con nanopartículas recubiertas con citrato no está limitado a las nanopartículas de Au; la misma estrategia Figura 2: (a) Imagen de TEM de un tubo de VMT mineralizado (con óxido de hierro), (b) Patrones de XRD de VMT mineralizado; tras ser sintetizado (patrón negro), recocido en aire (patrón azul) y recocido en vacío (patron rojo), (c) Magnetización como function del campo aplicado de tubos de VMT mineralizados y recocidos.