P53, a crucial target of mdm2 and the upsstudies of specificity and method development for purification of endogenously ubiquitylated proteins

Resumen

Dentro de la célula, el sistema ubicuitina-proteosoma (UPS) es un regulador fundamental de la estabilidad proteica. La pequeña molécula de 8.5 kDa, denominada ubicuitina, funciona como un modificador postraduccional y su unión covalente a diferentes sustratos, tiene un efecto dramático en la vida media de éstos, dirigiéndolos al complejo macromolecular proteolítico llamado proteasoma. La ubicuitina se une con sus sustratos a través de la acción de tres clases de enzimas: enzimas activadoras de ubicuitina (también llamadas E1s), enzimas conjugadoras de ubicuitina (E2s) y ligasas de ubiquitina (E3s). La acción concertada de estas enzimas permite unir la ubicuitina a la(s) lisina(s) de la proteína diana, específicamente reconocida por la E3. Las E3 contribuyen en la capacidad de reconocimiento específico de un sustrato en particular, aunque una única E3, pude reconocer más de una diana. Además de este papel crucial en la proteólisis, la ubicuitina también ejecuta funciones de modulador de numerosos procesos celulares, como la transducción de señales y localización subcelular. Como consecuencia de la degradación proteosomal y la de-ubicuitilación, las proteínas ubicuitiladas son muy inestables. Este hecho implica dificultades técnicas a la hora de intentar aislar cualquier factor ubicuitilado, planteando un importante desafío en la investigación de los mecanismos que unen los sustratos ubicuitilados con sus funciones específicas.La proteína supresora de tumores p53, es un componente crítico, requerido para suprimir el crecimiento de células cancérosas. Se han identificado varias ligasas de ubicuitina que reconocen y modifican p53, entre las cuales, Mdm2 juega un papel transcendental. Bajo condiciones fisiológicas normales, p53 es controlada por degradación proteosomal mediada por poli-ubicuitilación dependiente de Mdm2, mientras que bajo estrés celular, p53 en su forma tetramérica, se estabiliza y actúa como un factor de transcripción que induce la apoptosis o un paro en el ciclo celular. En este trabajo hemos utilizado una estrategia de transferencia de señales para identificar y delimitar las señales específicas de la proteína supresora de tumores p53, que son requeridas para su reconocimiento y su óptima degradación inducida por Mdm2. La mayoría de los experimentos, han sido realizados en un contexto celular transcripcionalmente silencioso para p53, evitando así los mecanismos de regulación, tanto negativos, como positivos, que afectan la estabilidad de este supresor tumoral, debido a la acción de cualquiera de los numerosos reguladores dependientes de p53. Como resultado de estas investigaciones hemos demostrado que: i) Señales discretas son necesarias Para llevar a cabo una degradación óptima inducida por Mdm2, son necesarias señales claramente delimitadas presentes en los regiones N y C terminal de p53. ii) Mdm2 induce la degradación de los mutantes de p53, con capacidad de tetramerización reducida (OD) a través del sistema UPS. Contrario a lo que sucede con la versión salvaje de p53 (WT), los mutantes OD son incapaces de tetramerizar eficazmente y se degradan gracias a un proceso que no requiere una poli-ubicuitilación eficiente. El mayor problema para la caracterización de p53 ubicuitilado, son las dificultades asociadas tanto al enriquecimiento como a la purificación de p53 modificado. Por esta razón, hemos desarrollado nuevas técnicas para aislar factores ubicuitilados a partir de extractos celulares. Estas técnicas se han basado en la afinidad natural que presentan los dominios asociados a ubicuitina (UBA) por esta molécula. Para el desarrollo de estas herramientas, hemos fusionado hasta cuatro repeticiones de dominios UBA dispuestos en tandem (que han sido denominadas TUBEs), de los proteínas hHR23A y ubiquilin1, para mejorar la captura de proteínas poli-ubicuitiladas. Las TUBEs muestran importantes incrementos en afinidad para cadenas de poli-ubicuitina, de hasta casi 1000 veces en comparación con dominios UBA individuales. Esto se corresponde con un cambio en la constante de afinidad de µM a nM, lo cual, se ve reflejado en la capacidad de las TUBEs para purificar proteínas ubicuitiladas extraídas de lisados celulares. Hay que destacar de forma importante la capacidad que presentan las TUBEs para proteger eficientemente los sustratos modificados, tanto de la degradación proteasomal, como de la de-ubicuitilación. En ultima instancia, las TUBEs desarrolladas se han aplicado para caracterizar la naturaleza de la ubicuitilación, que ocurre en mutantes OD de p53, así como, para el aislamiento de p53 ubicuitilado endógenamente a partir de células expuestas a estrés genotóxico.