Ancestral sequence reconstruction for protein engineeringimproving celulases for biomass hydrolysis

Resumen

Aplikazio industrialetan entzimak erabiltzea beharrezkoa da proteina-ingeniaritzaren hainbat teknika hobetzeko. Beharrezkoa da baldintza industrial askotan entzimak desaktibatzen dituzten muturreko kondizioak erabiltzen direlako. Kasu askotan, muturreko baldintzak jasateko gai diren entzimak erabiliz emaitza onak lortzen badira ere, beste kasu batzuetan, horiek hobetzea ere ezinbesteko bihurtzen da. Azken urteotan, entzima horiek hobetzeko esfortzu ugari egin da. Zuzendutako in vitro eboluzioa izan da, muturreko baldintza horiek lortzea helburu, bioteknologiak gehien erabili duen metodoa. Protokolo hau, ordea, oso garestia da; izan ere, mutanteen liburutegi bat sortu behar da lehenbizi, horren ondorioz aldagai ugari sortzen dira, eta hau guztia, gainera, esperimentalki egin beharreko zerbait da. Are gehiago, sortutako mutante guztiak probatzeko ezintasuna dela eta, prozesu honek ez du bermatzen entzima onenak hautatzen direla. Beraz, prozesua neketsua eta garestia izateaz gain, ez da oso eraginkorra kasu gehienetan. Hau horrela, bada azken urteotan erabiltzen hasi den beste teknika bat: antzinako sekuentzien berreraikuntza.Horretarako, antzinako proteinen berpizkundearen teknika berria erabiltzen da. Teknika horretan, organismo modernoen entzimen sekuentziak erabiltzen dira eta horien filogenia harremanak aztertzen dira. Zuhaitz filogenetiko bat lortzen den unean teknika estatistikoak aplikatu daitezke arbasoen sekuentzia lortzeko eta laborategian aztertzeko. Ikerketa gutxi egin dira, gaur egun arte, aipatutako teknikak izan ditzakeen aplikazio industriala eta biomedikoa aztertzeko. Berpiztutako proteinek egonkortasun termikoa, kimikoa edo zinetikoa duten propietate bereziak dituzte. Propietate horien hobekuntzak arrazoi bat dauka: gure planetak historian zehar izan dituen ingurumen-baldintza ezberdinak. Kondizio horietan bizi diren organismoen sekuentzia proteinak besterik ez dira aurkitu. Errendimendu handiak espero dira antzinako entzimak nahasiak direla erakusten baitute, hautakortasun txikiagoarekin lan egiten dute, eta beraz, substratu mota desberdinetarako eraginkorragoak dira.Zelulasen eraginkortasuna oso mugatua da 60 ° C-tik gorako tenperatura eta muturreko pH-etan. Hori dela eta, propietate horiek hobetzea da bioteknologia arloko ikerkuntzaren helburua. Zelulasak zelulosa hidrolizatzeko arduradun diren entzima talde baten izena da. Azaldutako teknika erabilita 3000 milioi urte arteko zelulasak berpiztu ditut. Egin ditudan azterketa guztietan antzinako zelulasen errendimendua neurtu ditut, industrian erabiltzen diren entzima komertzial batzuekin alderatuta. Neurtutako baldintza guztietan berpiztutako entzimen aktibitatea komertzialena baino handiagoa izan da, hala ere, tenperatura eta pH altuetan lortu ditut desberdintasun nabarienak. Hurrengo irudian (1go irudia) endozelulasa entzimarentzat egindako azterketa ikus daiteke. 1 irudia. Endozelulazarentzat egindako azterketa. a) Endozelulasaren kronograma edo arbola filogenetikoa. Bakterioen hiru erreinutako (aktinobakteria, firmikutes eta proteobakteria) 32 sekuentzia erabilita egin da zuhaitza. Bertako arbaso bat hartuta egin da berpizketa, b) Tenperaturaren menpe (30-90) pH 4.8-an egindako aktibitate espezifikoaren azterketa c) pH-rekiko (4-10) menpekotasun diagrama 50ºC-tan eginikoa.Irudian ikus daitekeenez, baldintza guztietan emaitza hobeak lortu dira antzinako entzima erabilita. Horretaz gain, antzinako koktelaren jardueraren azterketak egin dira (hiru zelulasa: endozelulasa, exozelulasa eta beta-glukosidasa), hainbat tenperaturatan substratu lignozelulosikoen degradazioa egin dut.Substratu idealak (CMC eta iragaz papera) erabiltzeaz gain, material lignozelulosiko desberdinekin azterketak egin ditut, hala nola, kartoia, batzeko papera eta egunkari-papera. Jarraian dagoen irudian (2.irudia) ikus daiteke. 2 irudia. Zelulasa koktelarentzat eginiko azterketa Koktel zaharreko jarduerak (CKA), koktel komertziala (CKC), koktel zaharrean T. pubescens laccase (CKA + L) eta komertzial koktelaren presentzia T. pubescens laccase (CKC + L) ikusgai 50-70 ºC-ko tenperaturan eta pH 4.8. Azterketak hiru substratu desberdinetan burutu ziren: kartoia (a), egunkaria (b) eta paperean (c).Azterketa guztietan antzinako zelulazen errendimendu hobea neurtu da, bai tenperatura altuetan, bai eta pH ezberdinetan ere. Biokonbertsio prozesuen (pH azidoa eta tenperatura altua) muturreko baldintzei aurre egiteko gaitasun hobea dutenaren hipotesia frogatu da, beraz. Horrela, prozesuaren kostua murriztu daiteke eta bere bideragarritasun industriala hobetuko litzateke. Baina ez hori bakarrik, gure antzinako koktelak material lignozelulosikoa degradatzeko erabiltzen diren beste entzima batzuekin daukan sinergia ere erakutsi dugu. Izan ere, material lignozelulosikoa zelulosaz gain, lignina eta hemizelulosaz osatua dago. Horiek hidrolizatzeko asmoz, lakasak eta xilanasak erabiltzen dira. Guk, azterketa honen bitartez, frogatu dugu gure entzimek beraien kabuz lan egiteaz gain, beste entzima horiekin lan egitean errendimendua asko hobetzen dela.Zelulasa disolbagarriez gain, bakterioek sortzen duten zelulasa makromolekular konplexu batek ere industriaren interes potentziala izan lezake, konplexutasun horren egonkortasunagatik. Bakterioek naturalki sortzen dituzten konplexu horiek zelulosoma deitzen dira. Gaur egun, ordea, zelulosoma sintetikoak ere diseinatu daitezke, zelulasa desberdinen osagai indibidualak konbinatzen zelulosoma-itxurako konplexuak ekoiztuz. Gure zelulasak erabiliz antzinako zelulosoma (endozelulasa, exozelulasa eta beta-glukosidasa) berri bat diseinatu eta sortu nahi da, tenperatura altuko, estres mekanikoko eta pH azidoaren inguruko industria-inguruneetan funtziona dezan.Material lignozelulosikoa lehengai ugaria da lurrean. Bioetanola ekoizteko erabiltzen da, baina bioetanolaren produkzioan entzimak muga dira oraindik. Zelulasa entzimek, euren gaitasunak mugatzen dituzten kondizio industrialetan, eraginkortasun handiko lanak behar dituzte. Bioetanolaren kasua da gure entzimak erabiliz hobetu litezkeen prozesuen adibideetako bat.