Study of the interactions between DNA and ionic liquids

Resumen

Los aptameros son ácidos nucleicos de ADN o ARN de hebra simple diseñados para reconocer específicamente una diana que puede ser, como ejemplo, células, proteínas, amino ácidos, drogas o incluso pequeñas moléculas. Estos exhiben propiedades similares a los anticuerpos, pero presentan una estabilidad significativamente más elevada que estos últimos. Los aptameros son seleccionados para la diana de interés a través del procedimiento automatizado in vitro llamado Evolución Sistemática de un Ligando por Enriquecimiento Exponencial - "SELEX". Estos pueden ser usados en biosensores o como elementos compuerta en nanoporos para aplicaciones de liberación controlada de drogas. Los aptameros pueden ser químicamente modificados con la introducción de un ligando y un par de fluoroforo y extintor de fluorescencia dando origen a una estructura tipo horquilla comúnmente llamado de farol molecular (molecular beacon - MB). Desde que fueron desarrolladas, las sondas de MB han sido ampliamente empleadas en biosensores debido a la facilidad de la detección de la señal de fluorescencia tras la interacción con la diana. Hasta ahora, estas sondas y el SELEX se han investigado y empleado principalmente en soluciones tampón acuosas. Sin embargo, debido a sus particulares propiedades físico-químicas, los líquidos iónicos (ILs) surgen como medio alternativo altamente interesante. Debido a que su presión de vapor es casi inexistente, esto es que prácticamente no se evaporan, los ILs tienen una gran ventaja respecto a los disolventes acuosos. La capacidad para disolver moléculas tales como los oligonucleótidos y al mismo tiempo ser capaces de experimentar interacciones electrostáticas, son también atractivas propiedades de los líquidos iónicos. Sin embargo, la información sobre las interacciones entre ADN o aptameros de ADN y líquidos iónicos es todavía limitada.Así, el principal objetivo de esta tesis fue el estudio de las interacciones de ADN con los líquidos iónicos y de la función de un aptamero de ADN en presencia de líquidos iónicos con propiedades físico-químicas distintas. En primer lugar se estudió la capacidad de reconocimiento y la selectividad del aptamero de ATP hacía la molécula de AMP en una solución acuosa con la presencia del liquido iónico prótico nitrato de etilamonio (EAN). Demostrándose que el aptamero de ATP permanece funcional con la presencia de EAN en la solución, otros líquidos iónicos fueron utilizados para entender la influencia de líquidos ionicos con diferentes propiedades físico-químicas en la estructura y función del ADN (lactato de colina (CL), nitrato de colina (CN), di-hidrogenofosfato de colina (CDHP), cloruro de 1-butil-3-metilimidazolio (BMIM-Cl) y lactato de 1,1,3,3-tetrametilguanidinio (TMGL)). Para eso, la hibridación y la estabilidad de una doble hebra de ADN constituida por 12 nucleótidos fueron estudiadas en solución con estos ILs. Diferentes tecnologías espectroscópicas, envolviendo la medición de la fluorescencia o el dicroísmo circular, complementadas por cálculos computacionales fueron usadas a lo largo de este trabajo. La posible influencia de estos líquidos iónicos en la emisión de la fluorescencia del fluoroforo usado, el Alexa Fluor 488, fue también investigada determinándose que cuando el AF 488 estaba libre en la solución, casi todos los líquidos iónicos disminuyeron la emisión de la fluorescencia. Por otro lado, cuando el AF 488 estaba ligado a una hebra simple de ADN, la fluorescencia se mantuvo prácticamente constante mismo con la presencia de estos ILs en solución. Estos resultados fueron entonces favorables para el uso de este sistema con AF 488 ligado al ADN en los estudios subsecuentes envolviendo líquidos iónicos en la solución. De esos estudios, se determinó que dependiendo del líquido iónico y de su concentración en solución, la función y estabilidad del ADN se mantuvieron.La segunda parte de este trabajo envolvió el proceso de SELEX, realizado por primera vez en presencia de un liquido iónico, el lactato de colina. El objetivo aquíera determinar hasta qué punto la introducción de un líquido iónico directamente durante el proceso de SELEX iría permitir que las secuencias de aptamero de ADN reconocieran la diana ATP y comparar la constante de reconocimiento molecular (Kd) con la obtenida usando apenas la solución tampón pura. A partir del SELEX en presencia de este líquido iónico se determinaron algunas nuevas secuencias de ADN potencialmente selectivos para el ATP, sin embargo, la medición final del Kd no pudo llevarse a cabo dentro del plazo de esta tesis.Como conclusiones generales, esta investigación permitió determinar que el ADN permaneció funcional en presencia de un entorno no fisiológico conteniendo liquido iónico. Considerando sus propiedades físico-químicas, no se determinó ningún patrón de interacción entre los líquidos iónicos. Por lo tanto, se concluyó que cada sistema debe ser caracterizado de manera independiente, incluso si los líquidos iónicos presentan cationes o aniones comunes. Nuevas secuencias de aptamero de ADN para el ATP fueron obtenidas a través del SELEX con la presencia de CL en solución lo que demuestra que, en un principio, este procedimiento de selección puede emplearse también con una solución no convencional.