Development of soft and rigid membrane nanotemplates for the mechanistic analysis of Dynamin I action on curved surfaces

Resumen

"En los últimos años se ha ido desvelando el rol activo de la curvaturade membrana en los procesos de reorganización de membranas celulares. Lamayoría de las membranas celulares presentan una cierta curvatura; dichacurvatura es moderada en los casos de orgánulos tubulares e incluso puedellegar a ser una curvatura extrema como es el caso de los poros de fisión yfusión. Experimentos in vitro en pequeñas vesículas unilamelares (SUVs) onanotubos lipídicos (NTs) muestran la efectividad de la curvatura demembrana en la segregación lipídica y formación de dominios activos entransformaciones morfológicas.El trabajo en esta tesis ha consistido en desarrollar herramientas invitro que nos ayuden a estudiar los procesos de elevada curvatura con laadecuada resolución espacial y temporal, y a su vez que nos permitanesclarecer los mecanismos de creación de curvatura de membrana y losprocesos de la remodelación celular. Los patrones lipídicos utilizados sepueden dividir en patrones blandos (NTs lipidicos) o patrones rígidos(nanoalambres de silicio (SiNWs) cubiertos de membrana).Los NT blandos utilizados poseen un diámetro luminal de variasdecenas de nanómetros y pueden tener desde unas decenas de nanómetroshasta micras de longitud. Los nanotubos más largos obtenidos a partir devesículas gigantes (GUVs), son más anchos pero permiten la visualizaciónsimultanea por microscopía de fluorescencia. Los nanotubos más cortos sonobtenidos a partir de bicapas lipídicas negras (BLMs), con mayor tensión quelos GUVs, por lo que poseen unos radios muy reducidos.La diferencia de radios de los NTs son el resultado de diversosparámetros mecánicos de la membrana que forma el tubo. Los parámetrosmecánicos que definen la geometría del NT son la rigidez a la flexión (k,definida por la composición lipídica) y la tensión lateral de la membrana (¿¿).En este trabajo la composición lipídica fue idéntica tanto para los GUVs comopara las BLMs, por lo que el radio de los NTs estaba regulado tan sólo por latensión lateral de la membrana origen.La determinación cuantitativa de los radios de los NTs se hacemediante el paso de una corriente eléctrica por el interior del NT demembrana. El NT de membrana ofrece una resistencia al paso de la corrienteque es función del área de la sección transversal del mismo, de tal forma queexiste una dependencia del radio del NT y de su longitud. Al incrementar oempequeñecer la longitud del NT obtenemos una respuesta en la medida deconductancia reduciéndose o agrandándose ésta. De esta forma se puedehallar el radio del NT.Para los NTs obtenidos a partir de GUVs se determinó que el voltajeafecta la forma del NT, dejando éste de ser cilíndrico. Se determina en estetrabajo que el radio del NT sufre una desviación !!"" !!! ! que depende de lalongitud total del NT. De tal forma que el gradiente de voltaje que existe enel tubo origina una variación en la tensión lateral y esto da como resultadouna forma de ¿trompeta¿ en el NT.Las medidas de conductancia sobre un NT permiten calcular en tiemporeal y simultáneamente los parámetros mecánicos de la membrana del NT.Se procede al calculo de dichos parámetros para varias composicioneslipídicas conocidas en la literatura actualComo se puede apreciar en lo anteriormente descrito, esta técnicaofrece una medida directa de la geometría del NT así como de los parámetrosmecánicos que la determinan y sirve como una inestimable ayuda para elestudio de la creación de nuevos compartimentos de membrana promovidospor la presencia de proteínas de fisión.La segunda parte de esta tesis está dedicada al estudio del proceso defisión promovido por la proteína dinamina I (Dyn1), siendo ésta el prototipode proteína de fisión. La Dyn1 es una guanosina-5¿-trifosfatasa (GTPasa) decasi 900 amino ácidos y 100 KDa. La Dyn1 es la proteína de fisión másestudiada ya que esta íntimamente envuelta en los procesos de endocitosismediados por la clatrina. Se sabe que precisamente la Dyn1 es laresponsable de la fisión de las vesículas en estos procesos.Sobre el modus operandi de la Dyn 1 in vivo se sabe que necesita laexistencia de un cuello de membrana de elevada curvatura (cuellomimetizado in vitro por un NT) para polimerizar sus monómeros alrededor deeste, hidrolizar las moléculas de guanosina-5¿-trifosfato (GTP) y por últimogestionar la fisión de la membrana. En este trabajo se hacen referencia a dosde los diferentes estados conformacionales de la Dyn1, uno el estado en elque el polímero se ha enlazado a la molécula de GTP y lo llamaremos de aquíen adelante estado basal y un segundo estado pre-hidrólisis en el que laDyn 1 sigue enlazada al guanosina difosfato (GDP) y al P que se llamaráestado de transición. La naturaleza efímera de éstos estados imposibilita elestudio de estas configuraciones transitorias. Para posibilitar la obtención deinformación debemos de parar el proceso en estos estadios. Usando unamutación de la Dyn1 en combinación con de una fijación química(crosslinker), nuestros colaboradores (Laboratorio de la Dra. Sandra Schmid,en UT Southwestern, Texas, EEUU) han conseguido crear una mutante delestado de transición de la Dyn1. Ello nos permitió estudiar el papel que juegaesta configuración de la proteína en el proceso de fisión de la membrana.Cuando este mutante se añadió a los NT blandos, se observó la formación deun estado de hemifisión de la membrana, que nunca antes se habíadetectado in vitro. Cabe destacar que la formación del estado de hemifisiónde la membrana sólo fue posible en ausencia de GTP. La adición de GTPpromovió la desestabilización del andamiaje de la dinamina, disminuyendo sucapacidad de constricción de la membrana. Todo ello, unido a datosobtenidos por técnicas complementarias permitió proponer un mecanismodetallado de la fisión de la membrana por la dinamina, donde se da granimportancia a la inserción coordinada de los dominios PH de la dinaminadentro de la membrana para la formación del estado de hemifisión. La fisióncompleta es una consecuencia de la hidrólisis del GTP por la proteína y deldesensamblaje del polímero de dynamina sobre la membrana.En la última parte de la tesis se ha estudiado la interacción de la Dyn1con los NT rígidos formados por nanoalambres de silicona recubierdos debicapa lipídica. Éstas plantillas además de ser rígidas presentan la forma dehemicilindro, por lo que la dinamina no puede ensamblarse en un circulocompleto encima de ellas. Se observó la formación de oligómeros de Dyn1encima de éstos hemicilindros. Además, éstos oligómeros preservan lahabilidad de hidrolizar GTP. El rol de estos oligomeros in vivo se aclarará enfuturos estudios. "