Human postmitotic neurons derived from NTERA2/D1 cells by short exposure to cytosine-b-D-Arabinofuranosidecharacterization of neurotransmitter phenotypes and role of phospholipase C b1 in differenti

Resumen

CARACTERIZACI¿N FENOT¿PICA DE NEUROTRANSMISORES Y PAPEL DE LA FOSFOLIPASA C ¿1 EN LA DIFERENCIACI¿N NEURONAL DE C¿LULAS NT2 DE TERATOCARCINOMA HUMANO MEDIANTE TRATAMIENTO CON CITOSINA-¿-D-ARABINOFURANOSIDO (AraC). ANTECEDENTES Y OBJETIVOSAunque, est¿ bien demostrado el papel de la isoforma PLC¿1 a nivel de membrana plasm¿tica y citoplasma en el metabolismo de fosfoinos¿tidos activado por muchos est¿mulos extracelulares, desde hace algunos a¿os se conoce la existencia de esta actividad enzim¿tica tambi¿n en el n¿cleo (Neri y cols., 1999; D¿Santos y cols., 2000). En ciertos modelos celulares de origen no neuronal (mioblastos C2C12), la transfecci¿n de mutantes de PLC¿1 que carece de la se¿al de localizaci¿n nuclear (NLS), inhiben la diferenciaci¿n celular, otorgando as¿, un papel importante a la PLC¿1 nuclear en dicho proceso (Faenza y cols. 2003; Faenza y cols., 2007). En cuanto al proceso de diferenciaci¿n neuronal, aunque escasas, existen evidencias que apuntan a la participaci¿n de la PLC¿1a/b en el proceso. En primer lugar, el an¿lisis de la expresi¿n y actividad funcional de la PLC¿1 (ARNm y prote¿na) en la corteza de cerebro humano adulto y fetal, muestra una elevada presencia de esta prote¿na en adultos, mientras que pr¿cticamente no se expresar¿a en la corteza cerebral fetal (Caricasole y cols., 2000; Peruzzi y cols., 2002; Ruiz de Az¿a y cols., 2006). Por otro lado, tanto ratones ¿knock-out¿ PLC¿1 (-/-) como mGluR5 (-/-) exhiben alteraciones en la formaci¿n de los denominados ¿barrels¿ de la corteza somatosensorial, demostrando as¿ la implicaci¿n de la v¿a de se¿alizaci¿n de PLC¿1, activada a trav¿s de receptores mGluR1, en el desarrollo de la corteza cerebral (Hannan y cols., 2001; B¿hm y cols., 2002; Spires y cols., 2005). Finalmente, en modelos celulares de diferenciaci¿n neuronal, como las c¿lulas NT2/D1 de teratocarcinoma humano, se ha descrito c¿mo su proceso de diferenciaci¿n hacia neuronas maduras NT2N se acompa¿a de un incremento de los niveles de expresi¿n de las prote¿nas G¿q/11, de la isoforma PLC¿1 y de la actividad fosfolipasa C (Novak et al, 2000). Por lo tanto, a pesar de haberse demostrado la participaci¿n de la PLC¿1 en los procesos de diferenciaci¿n neuronal, a¿n dicho conocimiento, ha sido ¿nicamente descrito desde un punto de vista fenomenol¿gico, encontr¿ndose a¿n por definir los mecanismos subyacentes a dicha participaci¿n. As¿, hasta la fecha no se ha descrito la importancia de cada una de las variantes de expresi¿n de la PLC¿1 (variantes 1a y 1b), ni tampoco ha podido atribuirse a alguna de las localizaciones subcelulares de PLC¿1 dicha participaci¿n. Por ello, en este trabajo proponemos el estudio de la implicaci¿n de la PLC¿1 en los procesos de plasticidad y diferenciaci¿n neuronal empleando un modelo celular de diferenciaci¿n neuronal, la l¿nea celular humana NT2/D1.Obtenci¿n, Validaci¿n y Caracterizaci¿n de un modelo de diferenciaci¿n de neurona humana: l¿nea celular NT2 de teratocarcinoma humano.Para llevar a cabo este estudio, en primer lugar, han sido desarrollados, validados y caracterizados dos protocolos de diferenciaci¿n de las c¿lulas NT2 a NT2N, mediante el empleo de dos inductores, el ¿cido retinoico (RA) o el antimit¿tico an¿logo de la citosina (AraC), bas¿ndonos en los trabajos de Andrews y cols., 1984 y Musch. y cols., 2010, respectivamente.De acuerdo a lo descrito ampliamente en la literatura, las c¿lulas neuronales obtenidas con el ¿cido retinoico (RA/NT2N) desarrollaron una citoarquitectura polar y forman axones y dendritas identificables morfol¿gicamente. Sin embargo, este protocolo presenta una serie de limitaciones: el tiempo de tratamiento es largo (2 meses), se obtiene un bajo rendimiento de c¿lulas NT2N (s¿lo el 5% de las cel¿las NT2 sembradas diferencian a NT2N) y por ¿ltimo, y debido a ello, es dif¿cil aplicar en ellas estrategias de biolog¿a molecular. Siguiendo el trabajo de Musch y colaboradores, hemos desarrollado otro protocolo de diferenciaci¿n, en el que tratando las c¿lulas con AraC durante tan s¿lo 6 d¿as, realizando un pase a las 72h y siembra en mayor confluencia, se obtuvieron tres veces m¿s neuronas diferenciadas (AraC/NT2N) que con RA.Mediante t¿cnicas de inmunofluorescencia y western blot, observamos que las c¿lulas neuronales NT2N obtenidas con ambos protocolos, expresaban marcadores neuronales tales como NF200, DCX y ¿-III-Tubulina, los cuales muestran un incremento en la immunoreactividad a lo largo de los protocolos de diferenciaci¿n con RA y con AraC. Incrementos en concordancia con lo observado en estudios previos para el modelo de RA/NT2N (Pleasure y cols., 1992; Couillard-Despress y cols 2008; Megiorni y cols., 2005). Como aproximaci¿n al estudio de la funcionalidad neuronal, se ha realizado un an¿lisis morfom¿trico de las c¿lulas neuronales obtenidas con ambos protocolos. Para ello, se tom¿ como referencia el trabajo de Haile y cols (2014) analiz¿ndose par¿metros como ¿rea total de la c¿lula, ¿rea del n¿cleo y soma, as¿ como el n¿mero de neuritas que presenta cada c¿lula y la longitud de ¿stas. Los resultados indican un soma y n¿cleo mayor en el caso de las AraC/NT2N, y una relaci¿n menor del ¿rea del n¿cleo respecto al soma de la c¿lula con respecto al obtenido con RA/NT2N. El an¿lisis morfom¿trico de las neuritas mostr¿ que las c¿lulasAraC/NT2N presentaban una longitud total de neuritas por c¿lula muy por debajo de los valores descritos en la literatura para el modelo RA/NT2N (Haile y cols., 2014). Quiz¿ periodos de tratamiento m¿s largos, el uso de factores de crecimiento o incluir cultivos con astrocitos promover¿an la obtenci¿n de un cultivo de c¿lulas AraC/NT2N con unas proyecciones de mayor longitud. En cualquier caso, los resultados experimentales aqu¿ presentados revelan que los progenitores NT2 pueden ser inducidos a diferenciarse en un corto per¿odo de tiempo y con una alta eficiencia en c¿lulas que cumplen los criterios generalmente aceptados para las neuronas postmit¿ticas, y subrayar que la diferenciaci¿n inducida por AraC de c¿lulas NT2 representa un valioso modelo para estudiar los mecanismos moleculares de diferenciaci¿n neuronal subyacentes.Finalmente, el estudio del fenotipo neurotransmisor de ambos modelos, mediante t¿cnicas de inmunofluorescencia y western blot, revel¿ fenotipos perfectamente diferenciados para cada modelo. As¿, las c¿lulas RA/NT2N obtenidas resultaron mayoritariamente gaba¿rgicas, mientras que las c¿lulas tratadas con AraC dieron lugar a un fenotipo neurotransmisor caracterizado por la co-expresi¿n de marcadores tanto glutamat¿rgicos como colin¿rgicos. Este fen¿meno ha sido descrito recientemente para progenitores neurales embrionarios del hipocampo (Bhargava y cols., 2010), lo que sugiere que el fenotipo de las c¿lulas AraC/NT2N, quiz¿ no se encontrar¿a completamente definido. Papel de la PLC¿1a/b en el proceso de diferenciaci¿n neuronal. Estudio en c¿lulas PC12, NT2, y corteza cerebral de rata.Con el fin de abordar el estudio de la implicaci¿n de la PLC¿1a/b en el proceso de diferenciaci¿n neuronal, en primer lugar, se valor¿ la localizaci¿n subcelular de cada una de las variantes de expresi¿n de la PLC¿1 en c¿lulas NT2 y en corteza cerebral de rata. Los resultados de immunofluorescencia en n¿cleos aislados de corteza cerebral de rata, indicaron que la PLC¿1 solo se encontraba en n¿cleos positivos para el marcador de neurona madura NeuN/Fox-3, demostr¿ndose a su vez su localizaci¿n en la parte interna de la membrana nuclear, donde el immunomarcado fue adem¿s positivo para el marcador de ¿nuclear speckles¿ sc-35. En cuanto a la distribuci¿n de ambas variantes, tanto en las fracciones celulares obtenidas a partir de corteza cerebral de rata, como en las c¿lulas NT2 progenitoras, la inmunoreactividad de PLC¿1a fue mayor a la de PLC¿1b en todas las fracciones estudiadas, aunque la contribuci¿n relativa de cada variante a la se¿al total difer¿a entre compartimentos subcelulares, siendo a nivel nuclear donde la diferencia era menor. Posteriormente, se valor¿ la participaci¿n de la PLC¿1a/b en el proceso de diferenciaci¿n, no s¿lo en los modelos de neurona humana bien caracterizados RA/NT2N y AraC/NT2N NT2, sino que tambi¿n se utiliz¿ el modelo celular neuronal de feocromocitoma suprarrenal PC12 (Greene y cols., 1976; Yang y cols., 2011). Cuando las c¿lulas PC12 son tratadas con NGF (Factor de crecimiento nervioso) adquieren caracter¿sticas de neuronas simp¿ticas, como cambios en la morfolog¿a; desarrollan excitabilidad el¿ctrica y desarrollan largas neuritas (Connolly y cols., 1979). El protocolo de diferenciaci¿n de NT2 a NT2N con RA o AraC, se vio acompa¿ado de un incremento en la expresi¿n de PLC¿1a/b, que fue anterior al observado para los marcadores neuronales NF200 y ¿-III tubulina. Resultados en concordancia con lo ya descrito por Novak y cols 2000 en el modelo RA/NT2N. Por el contrario, la diferenciaci¿n de las c¿lulas PC12 no dio lugar a cambios en la expresi¿n de PLC¿1. A continuaci¿n, mediante estrategias de biolog¿a molecular, se modific¿ la expresi¿n de la PLC¿1a/b en las c¿lulas PC12 y AraC/NT2N y se valor¿ el efecto que estos cambios produc¿an en el proceso de diferenciaci¿n neuronal, en t¿rminos de morfolog¿a celular y la expresi¿n de marcadores neuronales. En ambos modelos, el silenciamiento de la expresi¿n proteica de la PLC¿1a/b mediante el empleo de siRNAs, impidi¿ los cambios morfol¿gicos y de expresi¿n de los marcadores neuronales NF200 y ¿-III tubulina, inducidos por NGF o AraC. Adem¿s, la sobreexpresi¿n de cualquiera de las variantes de expresi¿n de la PLC¿1 en c¿lulas NT2, en ausencia de AraC, dio lugar a la aparici¿n de proyecciones neuronales y un incremento en la expresi¿n de ¿-III tubulina y NF200. Resultados que junto con los derivados del empleo de siRNAs, demuestra que la PLC¿1a y PLC¿1b no s¿lo son indispensables para inducir la diferenciaci¿n de las c¿lulas NT2 a NT2N con AraC, si no que ser¿an suficientes.En cuanto al mecanismo por el cual la PLC¿1a/b podr¿a estar modulando estos efectos, tal y como introducimos al comienzo de este informe, estudios en l¿neas celulares no neuronales, implican a la PLC¿1 nuclear en el mismo. Sin embargo, los resultados de western blot en fracciones subcelulares as¿ como de immunofluorescencia, revelan que los cambios de expresi¿n de la PLC ¿1a/b inducidos por el AraC, se corresponden esencialmente a cambios significativos a nivel citos¿lico y de membrana plasm¿tica, pero no nuclear. Si bien la participaci¿n de una prote¿na en un proceso no requiere necesariamente de cambios en su expresi¿n proteica, esta observaci¿n podr¿a estar indic¿ndonos la existencia de un elemento a trav¿s del cual la PLC¿1 citos¿lica podr¿a actuar a nivel nuclear. Recientemente, utilizando como referencia el extremo C-terminal de la PLC¿1, que contiene entre otros el sitio de uni¿n primario de la subunidad ¿q de la prote¿na Gq, y una se¿al de localizaci¿n nuclear, ha sido identificada una nueva prote¿na de interacci¿n de la PLC¿1, el factor X de asociaci¿n a Translin (TRAX) (Aisiku et al, 2010). La interacci¿n entre estas dos prote¿nas ya ha sido descrita en cultivos celulares como las c¿lulas HEK 293 o las PC12, donde usando t¿cnicas como coimmunofluorescencia, immunoprecipitaci¿n y FRET, han demostrado una localizaci¿n fundamentalmente citos¿lica del complejo TRAX-PLC¿1a (Aisiku y cols., 2010; Philip y cols., 2012). En cuanto a la participaci¿n de TRAX en el proceso de diferenciaci¿n de las c¿lulas PC12, cuando su expresi¿n es silenciada con siRNAs, ¿stas no muestran cambios en su morfolog¿a cuando son tratadas con NGF, sugiriendo la participaci¿n de TRAX en el proceso de diferenciaci¿n. Respecto al modelo neuronal de AraC/NT2N humano, se observa un incremento en su expresi¿n durante el proceso de diferenciaci¿n, incremento que desaparece cuando la expresi¿n de PLC¿1a/b es silenciada con siRNAs. Adem¿s, la sobreexpresi¿n de PLC¿1a, PLC¿1b o ambas producen un incremento en la expresi¿n de TRAX. Por lo que la expresi¿n de TRAX, al igual que la de NF200 y ¿-III-Tubulina, podr¿a estar modulada por la PLC¿1a/b. Sin embargo, el incremento de TRAX ser¿a posterior al incremento observado para PLC¿1a/b, y se localizar¿a a nivel nuclear, mientras que el de PLC¿1a/b se daba a nivel citos¿lico y de membrana plasm¿tica. Adem¿s, en nuestro modelo de diferenciaci¿n AraC/NT2N mediante la t¿cnica de FRET se observa que la interacci¿n de ambas prote¿nas s¿lo ocurre en el n¿cleo y a t¿rmino del tratamiento de diferenciaci¿n. Por ello, en el modelo AraC/NT2N, los resultados no sugieren una mediaci¿n de TRAX en la diferenciaci¿n dirigida por PLC ¿1 e inducida por AraC.En cuanto al rol que tendr¿a el complejo TRAX-PLC¿1a a nivel nuclear en el modelo de AraC/NT2N se encontrar¿a a¿n por definir. Seg¿n nuestros resultados, TRAX podr¿a encontrarse mediando en la actividad nuclear de la PLC¿1 y en procesos que ir¿an m¿s all¿ de la diferenciaci¿n neuronal. Futuros estudios que analizasen la funci¿n de este complejo en el n¿cleo neuronal ser¿an de gran inter¿s.