Cellular and molecular responses of zebrafish to legacy and emerging pollutantsthe specific cases of PAHs and metal oxide nanoparticles

Abstract

Diferentes tipos de xenobióticos, incluyendo compuestos orgánicos y metales, soncontinuamente vertidos al medio acuático como resultado de un sinfín deactividades de origen antropogénico. Las concentraciones de algunos de estoscontaminantes están reguladas (contaminantes prioritarios), mientras que tan solorecientemente han empezado a ser consideradas otras sustancias (contaminantesemergentes), a pesar de no tratarse necesariamente de compuestos nuevos. Latoxicidad de estos compuestos no es siempre conocida y, por tanto, es necesarioevaluar el impacto de su presencia en el medio ambiente para la salud humana y lade los ecosistemas.En este trabajo hemos pretendido profundizar en el conocimiento de losefectos y de los mecanismos subyacentes a la toxicidad/carcinogenicidad de dos delas principales clases de contaminantes ambientales: los hidrocarburos aromáticospolicíclicos (HAPs) y las nanopartículas (NPs) de óxidos metálicos utilizando el pezcebra (Danio rerio) como modelo experimental.Los HAPs son potentes carcinógenos capaces de inducir la formación detumores tanto mediante mecanismos genotóxicos como no genotóxicos. En estetrabajo hemos empleado dos HAPs; el benzo(a)pireno (B(a)P) y el 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA), cuya toxicidad es el resultado directo de suinteracción inespecífica con las zonas apolares de las células (narcosis) así como desu interacción con el receptor de aril-hidrocarburos (AHR). A pesar de la informaciónexistente sobre la toxicidad y carcinogenicidad de los HAPs, todavía existenpreguntas sin respuesta en lo que refiere a los procesos alterados por estoscompuestos, así como al transcurso temporal de los mismos.Cuando un organismo se expone a un compuesto químico, la respuestabiológica depende de las propiedades físico-químicas del compuesto, pero tambiénde la concentración y de la duración de la exposición. En el capítulo I expusimospeces cebra adultos a diferentes concentraciones (0, 0,3, 0,6 y 1 mg/L) de DMBAdurante 72 h con el objetivo de analizar los efectos agudos producidos por estepotente carcinógeno y así determinar una concentración apropiada paraexposiciones de mayor duración.La exposición a 1 mg/L de DMBA resultó letal para el 80 % de los individuosexpuestos y afectó al resto de los individuos produciendo daño clastogénico sobre elDNA. Además, de acuerdo con el test de estabilidad de la membrana lisosómica, lasconcentraciones más bajas deterioraron el estado general de salud de los peces.Estos resultados junto con la bibliografía existente, indicaron la idoneidad de laconcentración de 0,3 mg/L de DMBA para su utilización en experimentosposteriores. Por tanto, en un segundo experimento se estudiaron y compararon losefectos del B(a)P y el DMBA tras una o dos semanas de exposición a 0,3 mg/L.La capacidad carcinogénica de los HAPs radica en su capacidad parainteractuar directamente con el DNA, así como del estrés oxidativo resultante de lasobreproducción de radicales de oxígeno originados durante el metabolismo de faseI. Tanto en los animales expuestos a B(a)P como a DMBA se observó un incrementosignificativo de la transcripción de los genes del citocromo P450 (cyp1a, cyp1b),cuyos productos proteicos participan en la bioactivación de los HAPs. Además, lainducción de cyp1b permaneció alterada tras dos semanas de exposición. Los pecesexpuestos a DMBA también mostraron un incremento significativo de latranscripción de junb tras dos semanas de exposición sugiriendo la existencia dedaño tisular.Estos resultados sugieren que tras dos semanas de exposición la respuestaadaptativa sigue activa. Como era de esperar no se detectaron lesiones cancerosasen el hígado, pero la exposición a ambos HAPs causó un deterioro del estado generalde salud de los peces cebra, identificado como una reducción de la estabilidad de lamembrana lisosómica y produjo proliferación de peroxisomas. La proliferación deperoxisomas es un proceso temprano que ha sido relacionado con la aparición decáncer en roedores y que se sabe que precede la proliferación de hepatocitos. Por suparte, las alteraciones lisosómicas, como la reducción de la estabilidad de lamembrana lisosómica, han demostrado su valor pronóstico como biomarcadorestempranos de carcinogénesis en peces.Para profundizar en los eventos tempranos que ocurren en tras laexposición a B(a)P y DMBA, en el capítulo II llevamos a cabo un análisistranscriptómico de genoma completo con los peces del segundo experimentodescrito anteriormente. Ambos HAPs produjeron una respuesta transcriptómicasimilar que varió de la primera a la segunda semana de exposición, sugiriendo laexistencia de eventos iniciales comunes tras la exposición a ambos HAPs y reflejandoademás la existencia de un marcado efecto temporal. Estos eventos inicialesincluyeron la alteración de la transcripción de genes involucrados en la respuestaadaptativa al insulto químico, entre ellos, los ya mencionados cyp. Además, se redujola transcripción de genes relacionados con el ciclo celular tras la primera semana deexposición indicando una posible parada del ciclo celular como parte de la respuestacompensatoria a los efectos dañinos de los HAPs. Este efecto revirtió en la segundasemana de exposición indicando una posible pérdida del control sobre el ciclocelular. Los resultados también revelaron que los HAPs alteran la transcripción degenes relacionados con la gametogénesis siguiendo el mismo patrón detranscripción observado en los genes relacionados con el ciclo celular. En base aestos resultados nos planteamos la hipótesis de la existencia de comunicacióncruzada entre las rutas del AHR y el receptor de estrógenos. La unión al receptor deestrógenos por parte de los HAPs es considerada un mecanismo no genotóxico decarcinogénesis y podría, por tanto, contribuir al efecto carcinogénico de estoscompuestos.A pesar de la similitudes en las respuestas producidas por el B(a)P y por elDMBA, los HAPs producen perfiles de expresión génica distinguibles en función de supotencial carcinogénico. En consecuencia, el 16% de la variabilidad total observadaen el análisis del transcriptoma se atribuyó a efectos específicos producidos por cadauno de los compuestos y se detectaron diferencias significativas tras la primerasemana de exposición. El DMBA afectó a procesos de degradación de proteínas ycoagulación sanguínea, mientras que B(a)P produjo efectos mayores sobre la yamencionada regulación del ciclo celular observada en animales expuestos a amboscompuestos. Tras la segunda semana de exposición, no se observaron diferenciassignificativas entre las respuestas transcriptómicas producidas por el B(a)P y elDMBA. La mayor similitud entre las respuestas podría estar ligada a una respuestacomún a la existencia de daño semejante tras ambas exposiciones, lo queconcordaría con los resultados obtenidos para el test de estabilidad de la membranalisosómica en el capítulo I.El análisis de rutas indicó que el B(a)P y el DMBA alteraron principalmenterutas relacionadas con el metabolismo. Las alteraciones en el DNA y en elmetabolismo energético son marcas distintivas de células cancerígenas. En nuestroestudio, ambos HAPs afectaron al metabolismo de bases nitrogenadas requeridopara la síntesis y reparación del DNA junto con las rutas involucradas en el balanceenergético. La alteración de estas rutas apoya la idea de la existencia de un efectocompensatorio y un posterior incremento del ciclo celular en los peces expuestos aB(a)P. Mientras tanto, las rutas afectadas por la exposición a DMBA evocaron eldenominado ¿efecto Warburg¿, un fenómeno descrito en células proliferativasnormales así como en células cancerosas. En base a los resultados, sugerimos quetras la exposición a DMBA el metabolismo de la glucosa puede ser redirigido hacia laruta de las pentosas fosfato para producir los nucleótidos necesarios para la síntesisde DNA así como para hacer frente a los requerimientos energéticos y antioxidantes.Por último, ambos HAPs alteraron el metabolismo del glutatión. En el caso de lospeces expuestos a B(a)P, este efecto puede estar relacionado con las propiedadesantioxidantes del péptido. Por otro lado, en los animales expuestos a DMBA seredujo la transcripción de genes relacionados con esta ruta, lo que podría estarrelacionado con la existencia de procesos apoptóticos. A la vista de los resultadosobtenidos en los capítulos I y II, ambos HAPs pueden contribuir a la producción de unentorno bioquímico propicio para el desarrollo de lesiones cancerosas.Con el objetivo de profundizar en el conocimiento existente sobre lasconsecuencias de la exposición a B(a)P y a DMBA, en el capítulo III investigamos losefectos producidos a largo plazo por una exposición corta (24 h) durante eldesarrollo embrionario a distintas concentraciones (0,3-1 mg/L) de cada uno deestos HAPs de forma individual o secuencial. La transcripción de genes relacionadoscon el desarrollo de cáncer se analizó en distintos momentos a lo largo de 12semanas tras el fin de las exposiciones. Los efectos histopatológicos producidos en elhígado también se evaluaron al final del experimento.La exposición a B(a)P y especialmente a DMBA causó una fuerte inducciónde la transcripción de cyp1a de forma concentración dependiente tan solo 24 hdespués del cese de la exposición, sugiriendo la capacidad de producir iniciacióntumoral en estadios tempranos de desarrollo. Como ya se observó en el capítulo I, laexposición a 1 mg/L de DMBA resulto letal tras 24 h de exposición. Las exposicionessecuenciales a B(a)P y DMBA, diseñadas para entender la capacidad iniciadora ypromotora de estos compuestos, produjeron la mayor inducción de cyp1a. Ademásse observó un patrón de transcripción muy similar para los genes p53, ccng1 y junb,siendo la inducción de junb significativa en aquellos animales expuestos a laconcentración más alta de B(a)P tras 24 h de exposición. Sin embrago, estostratamientos resultaron letales tras las primeras 24 h. Por tanto, los efectos sobre latranscripción de los genes observados tras 24 h podrían estar relacionados con lamortandad observada en los embriones expuestos secuencialmente. Nuestrosresultados sugieren que tras una exposición aguda a HAPs, la biodisponibilidad(concentración y tiempo de exposición) de los compuestos, así como la afinidadhacia el AHR son factores que determinan la transcripción de cyp1a. Además, laexistencia de cambios epigenéticos ocurridos durante la exposición a los HAPs podríahaber afectado la expresión temporal de los genes analizados.Cyp1a se mantuvo significativamente inducido en animales expuestos aDMBA a las 3 y 6 semanas post exposición y el patrón de transcripción observado enel resto de genes analizados sugirió la existencia de daño en el DNA. En consonanciacon los resultados obtenidos en el capítulo II, la transcripción de p53 y ccng1 sugirióque en aquellos peces expuestos a DMBA el ciclo celular podría estar alterado.También se detectó inducción de p53 y junb en animales expuestos a B(a)P, quepodrían igualmente llevar a la parada del ciclo celular. 12 semanas tras el fin de lasexposiciones agudas no se identificaron genes cuya transcripción se mantuvierainducida, ni se identificó daño clastogénico alguno. Por tanto, y a tenor de losresultados obtenidos, pudo haber existido daño sobre el DNA que no se tradujo endaño cromosómico. Además en el pez cebra, el desarrollo de tumores tras laexposición por dieta a HAPs ha sido descrito sin que se detectaran efectosgenotóxicos. El análisis histopatológico reveló la existencia de lesiones tisulares notumoralesen los animales tratados, que aunque en menor medida, también fueronobservadas en los peces control. Los peces expuestos presentaron una mayorprevalencia de lesiones histológicas tales como la megalocitosis hepática que escausada por daño de los tóxicos al DNA o al aparato mitótico tras la exposición acarcinógenos, pero cuya presencia en niveles basales también ha sido descrita enpeces no tratados. También se detectaron alteraciones en el contenido lipídicodemostrando la capacidad dañina a largo plazo de exposiciones producidas en lasetapas embrionarias. Por tanto, la exposición a HAPs en estadios embrionariospuede producir efectos a largo plazo como resultado de su interacción inespecíficacon las estructuras celulares, así como de los daños no clastogénicos sobre el DNAoriginados por sus formas activas.Junto con los contaminantes prioritarios como los HAPs, nuevoscontaminantes derivados de las actividades antropogénicas son continuamenteintroducidos en las masas de agua. Durante las últimas décadas los nanomaterialesse han incorporados a diferentes productos de aplicación industrial y doméstica. LasNPs de óxidos metálicos son de especial interés en ciertos productos y son, portanto, producidas y vertidas al medio en una cantidad considerable. Las formassolubles y masivas de los óxidos metálicos son tóxicas para los organismos acuáticosindicando la posibilidad de efectos negativos para la biota también en el caso de lasformas nanoparticuladas. Dichos efectos, dadas las propiedades únicas de las NPs,podrían ser diferentes a aquellos producidos por las formas soluble y masiva de losmetales. En los capítulos IV y V se pretendió analizar la toxicidad de NPs de óxidosmetálicos. Para contribuir al conocimiento existente sobre la toxicidad de las NPs deóxidos metálicos, planteamos una estrategia en dos fases.En una primera fase (capítulo IV) se comparó la toxicidad de tres NPs deóxidos metálicos (CuO, ZnO y TiO2) de amplia utilización en productos de consumocon la toxicidad producida por sus equivalentes no nanoparticulados empleandopara ello embriones de pez cebra.El test de toxicidad en embriones nos permitió clasificar la toxicidad de lasNPs en base a los parámetros subletales analizados. Las NPs de CuO resultaron serlas más tóxicas. Su efecto nocivo (retraso de la eclosión, incremento de la tasa demalformaciones) se observó a la concentración de 1 mg Cu/L. En segundo lugar, lasNPs de ZnO causaron efectos perjudiciales a 5 mg Zn/L (retraso en la eclosión),mientras que las NPs de TiO2 fueron las menos toxicas y la toxicidad causada por laformulación se atribuyó al surfactante presente en la suspensión. Identificamos lasolubilidad como un parámetro clave para la toxicidad de las NPs de óxidosmetálicos. Tanto las NPs de CuO como las de ZnO redujeron la tasa de eclosión enembriones expuestos a 10 mg/L y retrasaron la eclosión a concentracionesinferiores. En su conjunto los datos indicaron que la composición química de las NPs,responsable de parámetros tales como la solubilidad, así como los aditivos presentesen las suspensiones, son variables clave al considerar la toxicidad de las NPs.En comparación con las NPs, las formas iónicas del cobre y el zinc resultaronsignificativamente más tóxicas. Por tanto, los iones liberados de las NPs podrían serlos principales responsables de la toxicidad de las NPs. Las NPs de CuO ejercieron sutoxicidad subletal a concentraciones más bajas que el CuO masivo, mientras que lasNPs de ZnO produjeron efectos similares al ZnO masivo para los parámetrosconsiderados. La mayor toxicidad de las NPs de óxidos metálicos en comparación alas formas masivas equivalentes podría estar relacionada con la precipitación, que enel caso de las exposiciones de embriones, conduciría a la acumulación de NPs en lasuperficie del corion. La acumulación de metales en tejidos detectada porautometalografía concordó con el patrón de toxicidad anteriormente descrito,apoyando la idea de la importancia de la solubilidad como un parámetro clave en latoxicidad de las NPs. En general concluimos que a las concentraciones ambientalesactuales, ninguna de las NPs testeadas supone un riesgo para el medio acuático. Sinembargo, antes de descartar el riesgo asociado a las NPs de óxidos metálicos sedeben considerar otros factores. Dada la toxicidad observada para el surfactantepresente en la suspensión de las NPs de TiO2, se debe prestar especial atencióntambién a los compuestos presentes en sus formulaciones. Además a la hora deevaluar la toxicidad de NPs es importante considerar no solo la mortalidad, sino losparámetros subletales. De otra manera, la toxicidad de las NPs podría sersubestimada. En cualquier caso, la presencia de metales en el medio ocurre enforma de mezclas complejas, y por tano, el riesgo asociado a la toxicidad totaldebería ser tenido en cuenta.Basándonos en los resultados del capítulo IV seleccionamos las NPs de CuOpara la segunda fase de nuestra estrategia, en la que analizamos sus efectos en unexperimento de mayor duración con individuos adultos (capítulo V). Las NPs de CuOson contaminantes relativamente nuevos en el medio ambiente. Por elloseleccionamos una concentración ambientalmente relevante con el fin de evaluar losefectos de las NPs de CuO en comparación con los efectos producidos por la formaiónica del cobre. Empleamos una concentración de 10 ¿g Cu/L en las exposiciones yrecogimos muestras a los 3 y 21 días de exposición, así como a los 6 meses postexposición. De esta manera pretendimos estudiar la posible reversibilidad de losefectos detectados durante la exposición y detectar existencia de efectos a largoplazo como alteraciones histopatológicas, incluyendo la aparición de tumores. Comose observó en el capítulo IV, los animales expuestos a la forma iónica acumularonmayor cantidad de cobre, demostrando la mayor biodisponibilidad de la formaiónica del cobre iónico y el riesgo de exposiciones prolongadas. Al igual queobservamos en las exposiciones a HAPs, el test de estabilidad de la membranalisosómica indicó la existencia de un deterioro significativo en la salud de losanimales expuestos a cualquiera de las dos formas del cobre analizadas. A niveltisular no se detectaron alteraciones histopatológicas en el hígado. Sin embargo, seobservaron alteraciones histopatológicas en las branquias en todos los grupos deexposición. Consecuentemente, la exposición a NPs de CuO o a cobre iónico podríacomprometer la absorción de oxígeno y contribuir a una hipoxia sistémica.De acuerdo con la ausencia de efectos histológicos en el hígado, lasexposiciones a cobre alteraron levemente el transcriptoma hepático. El análisissugirió que tras 3 días de exposición las NPs de CuO pueden producir estrésoxidativo, así como una reducción de procesos relacionados con el metabolismo y eltransporte, mientras que el cobre iónico pudo producir daño en el DNA a los 21 días.El análisis del transcriptoma mostró una tendencia en las respuestas producidas porlas dos formas del metal a tornarse más parecidas a los 21 días de exposición. Elposible daño en el DNA no se detectó como actividad clastogénica. En cualquier casola fiabilidad de este ensayo para analizar la genotoxicidad de las NPs aconcentraciones ambientalmente relevantes debería de ser validada antes dedescartar el potencial genotóxico de las NPs. En general los datos indicaron que lasexposiciones a cobre en concentraciones ambientalmente relevantes resultan en eldeterioro del estado de salud de los peces, así como en la acumulación de metalesque podría producir efectos nocivos tras exposiciones de mayor duración.Esta tesis doctoral ha tratado de contribuir a completar las carenciasexistentes en la comprensión de los efectos producidos por los HAPs y las NPs deóxidos metálicos y ha servido para adquirir conocimiento sobre los mecanismosmoleculares y celulares afectados. Además, los datos indican que algunos de losefectos producidos por los HAPs y las NPs de CuO podrían ser comunes, como lareducción de la estabilidad de la membrana lisosómica y la inducción de latranscripción de genes relacionados con el daño en el DNA.