Estudio de los determinantes moleculares que modulan la resistencia del conejo a la infección por priones utilizando un modelo de propagación in vitro

Resumen

Pion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are a family of rare progressive neurodegenerative disorders distinguished by long incubation periods and characteristic spongiform changes associated with neuronal loss. The causative agent of TSEs is an abnormally folded prion protein (PrPSc) that is capable to transform the normal cellular prion protein (PrPC) in new infectious transmissible PrPSc. The progressive accumulation of PrPSc finally leads to brain damage and the characteristic signs and symptoms of these fatal diseases. Since the 60¿s, TSEs have been described in several mammalian species appearing either naturally (scrapie in sheep, BSE in cattle, CWD in cervids, CJD in human) or by experimental transmission studies (scrapie in mouse or hamster). Prion diseases can be transmitted from one species to another albeit not with the same efficiency. Although many aspects of the prionopathies have been solved in the last 40 years, such as the etiological agent or the fact that prions occur in the form of different strains that show distinct biological and physicochemical properties, there are still many open questions regarding the strain phenomenon and interspecies transmissibility. Apart from transmissibility studies performed by experimental challenges, the BSE outbreak occurred in the UK in the 90¿s showed that while some species were readily affected (as mice or felines), others did not develop TSE (as rabbits, dogs, horses) even after being exposed to the same agent and with PrP sequences similar to the susceptible ones.Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) is a technique that mimics the prion replication (PrPC to PrPSc conversion) in vitro with a similar efficiency to the in vivo process but with accelerated kinetics. The recent development of the recombinant-PMCA (rec-PMCA) has permitted to change the source of PrPC from brains to recombinant protein, allowing a fast, easy and cheap way to study mutations that affect the conversion process, the species barrier or structural characteristics of the PrPSc among others.In an attempt to study the mechanisms involved in the high resistance to TSEs of certain species, the mouse-rabbit transmission barrier was used as a model. To study which are the specific amino acids that determine the susceptibility/resistance to prion propagation, rec-PMCA was used. This new technology allows easy amino acid substitutions in rabbit PrP and rapid analysis of their misfolding propensity when inoculated with a wide range of prion strains. Since the wild type (wt) rabbit recombinant PrP could not be misfolded by serial rec-PMCA rounds with at least a dozen of prions from a diversity of origins, a series of rabbit recombinant PrP mutants were designed containing every single amino acid substitution compared to mouse recombinant PrP. At least three promising key substitutions have been found that make rabbit recombinant PrP highly susceptible to misfolding and using these intermediate mutant misfolded PrPs, misfolded recombinant rabbit PrP was generated. Several studies were done to further characterize the effect and possible mechanisms by which the critical substitutions increased recombinant rabbit PrPs misfolding propensity, but further structural studies on the rabbit PrP mutants detected are required to fully understand the mechanism behind rabbit¿s resistance to prion disorders. Las enfermedades priónicas o encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un grupo de trastornos neurodegenerativos progresivos que se caracterizan por largos periodos de incubación y por cambios espongiformes característicos asociados a la pérdida neuronal. El agente causante de las EETs es una proteína anormalmente plegada denominada PrPSc que es capaz de transformar la proteína de prion celular o PrPC en su isoforma patógena. La acumulación progresiva de PrPSc conduce a daño cerebral y a la aparición de signos y síntomas característicos de estas enfermedades fatales. Desde los años 60, se han descrito EETs en una gran variedad de especies de mamífero, detectadas en la naturaleza (scrapie en ovejas, EEB en vacas, EDC en cérvidos, ECJ en humanos) o causadas mediante estudios de transmisión experimental (scrapie en ratones o hámsteres). Las enfermedades priónicas pueden transmitirse de una especie a otra aunque no siempre con la misma eficiencia. A pesar de que se han aclarado muchos aspectos acerca de las prionopatías durante los últimos 40 años, como el agente etiológico o el hecho de que los priones aparecen en forma de diferentes cepas que muestran diferentes propiedades biológicas y fisicoquímicas, quedan aún muchas incógnitas en lo que respecta al fenómeno de cepas y a la transmisibilidad interespecífica. Junto con los estudios de transmisibilidad, el brote epidémico de EEB ocurrido en Reino Unido en los años 90, mostró que mientras algunas especies se afectaban rápidamente por la enfermedad (como ratones o felinos), otras no llegaban a desarrollar EETs (como los Conejos, cánidos y caballos), incluso después de una probada exposición al mismo agente infeccioso y a pesar de que las secuencias aminoacídicas de sus PrPs son similares a las de especies susceptibles. La técnica de amplificación cíclica de proteínas malplegadas (del inglés, PMCA) mimetiza la replicación de priones (conversión de PrPC a PrPSc) in vitro con una eficiencia similar al proceso que ocurre in vivo, pero con una cinética acelerada. El reciente desarrollo de la PMCA recombinante (rec-PMCA) ha permitido cambiar el origen de la proteína PrPC de encéfalos a proteína recombinante de origen bacteriano. Esto está permitiendo estudiar de una forma rápida, fácil y económica, entre otras, las mutaciones que pueden afectar al proceso de conversión, la barrera de transmisión o las características estructurales de la PrPSc.Con la intención de comprender los mecanismos implicados en la resistencia que presentan determinadas especies a las EETs, se ha estudiado la PrP de conejo, utilizando la barrera de transmisión ratón-conejo como modelo. Para determinar qué aminoácidos modulan la susceptibilidad/resistencia a la propagación de priones se decidió utilizar la rec-PMCA. Esta nueva tecnología permite realizar fácilmente sustituciones aminoacídicas a la PrP de conejo y analizar la propensión al malplegamiento de las PrP mutadas frente a una variedad de cepas priónicas. Como la PrP recombinante de conejo de genotipo wild type (wt, del inglés, salvaje) no pudo ser malplegada directamente utilizando rondas seriadas de rec-PMCA y al menos una docena de priones de diversos orígenes, se construyó toda una serie de PrP recombinantes de conejo con cada una de las sustituciones de la PrP murina. Al someterlas a rondas seriadas de rec-PMCA con priones murinos, se identificaron al menos tres sustituciones que hacían que las PrP recombinantes de conejo mutadas fueran más propensas a la propagación de priones murinos. Y estos mismos mutantes intermedios utilizados como semilla de rec-PMCA indujeron el malplegamiento de la PrP recombinante de conejo wt. Se realizaron además diversos estudios para la caracterización del efecto de estas sustituciones y para aclarar posibles mecanismos por los que se incrementa la propensión al malplegamiento de la PrP recombinante de conejo. No obstante, se requerirán estudios estructurales más detallados de las PrP mutadas detectadas para entender completamente el mecanismo molecular que se esconde tras la resistencia de los conejos a las enfermedades priónicas