New Oncogenic Drivers in Hepatocellular CarcinomaRole of the RNA Binding Protein Hu antigen R

Resumen

RESUMENLa enfermedad hepática crónica es una de las principales causas de mortalidad en humanos.Comprende enfermedades con diferentes etiologías como la infección por los virus de la hepatitis B y C,toxinas, consumo de alcohol y drogas, enfermedades autoinmunes y hereditarias y la enfermedad del hígadograso no alcohólica (EHGNA). La EHGNA es una de las principales enfermedades hepáticas crónicas en lospaíses desarrollados, asociada con los factores de riesgo del síndrome metabólico (obesidad, resistencia a lainsulina, dislipidemia e hipertensión), e incluyendo alteraciones que van desde la esteatosis hasta laesteatohepatitis no alcohólica (EHNA), que en algunos casos puede ir acompañada de fibrosis. Los pacientesde EHNA con presencia de fibrosis pueden llegar a desarrollar carcinoma hepatocelular (CHC).El CHC representa la tercera causa de muerte por cáncer, y la primera causa de muerte en pacientescirróticos. El CHC es el cáncer más prevalente en la población, con mal pronóstico incluso en los paísesdesarrollados. Su etiología es diversa, con los virus de la hepatitis B y C, el alcoholismo, la aflatoxina B1 y elEHGNA como principales factores de riesgo. Entre los factores moleculares involucrados en la progresióndesde EHGNA a CHC podemos encontrar el estrés oxidativo, el metabolismo de la metionina y la disfunciónde p53. Numerosos estudios han mostrado que los pacientes cirróticos con alto riesgo de desarrollar CHCpresentan una desregulación del metabolismo de la metionina y unos niveles anormales de Sadenosilmetionina(SAMe).La S-adenosylmetionina es el principal donador biológico de grupos metilo, y el hígado aparece como elprincipal responsable de su homeostasis. SAMe juega un papel fundamental en la proliferación de loshepatocitos y su diferenciación, y en la apoptosis de células tumorales. En el hígado SAMe es capaz deinhibir la activación de la ruta LKB1/AMPK/eNOS y evitar la translocación al citoplasma de HuR, una proteínade unión al ARN, siendo ambos mecanismos importantes para la proliferación de los hepatocitos y laregeneración hepática. Por tanto, los niveles de SAMe deben estar estrechamente regulados. Las dosprincipales enzimas responsables de la síntesis y el catabolismo de SAMe son la metioninaadenosiltransferasa (MAT) y la glicina N-metiltransferasa (GNMT), respectivamente. La enzima MAT estácodificada por dos genes, MAT1A y MAT2A. MAT1A codifica para la formación de las enzimas MAT I y MATIII, y MAT2A codifica para MAT II. MAT1A se expresa en el hígado adulto y diferenciado, mientras queMAT2A se expresa en el hígado fetal y en proliferación. Durante el desarrollo del hígado hay un cambio en laexpresión desde MAT2A hasta MAT1A, y durante la proliferación y la desdiferenciación hepáticas y durantela transformación maligna, los niveles de expresión de MAT1A se reducen junto con un aumento en laexpresión de MAT2A. La regulación de la expresión de MAT1A y MAT2A se ha relacionado con la metilaciónde los promotores y la acetilación de las histonas asociadas a ellos.Por otra parte, la enzima GNMT, responsable de la catabolización de SAMe, está presente en grandescantidades en el hígado, y muy reducida en tumores hepáticos y prostáticos. Se han encontrado individuoscon mutaciones en GNMT que espontáneamente desarrollan enfermedad hepática. La enzima GNMT regulael ratio SAMe a SAH, el cual es considerado como el índice del potencial de transmetilación de la célula. Ladesregulación de este ratio puede resultar en metilaciones aberrantes.Con el fin de estudiar las implicaciones de la desregulación del nivel de SAMe en el hígado, segeneraron dos modelos de ratones knockout, MAT1A-KO y GNMT-KO, caracterizados por niveles de SAMecrónicamente disminuidos y elevados, respectivamente. El ratón MAT1A-KO presenta estrés oxidativo ydesarrolla esteatosis y EHNA a los 8 meses, y finalmente CHC. El ratón GNMT-KO desarrolla esteatosis,fibrosis y CHC. La observación de que tanto los altos como los bajos niveles de SAMe provocan unapatología similar subrayan la importancia del mantenimiento de la homeostasis de SAMe.La regulación de los niveles de SAMe está relacionada con la regulación de la expresión de los ARNmde MAT1A y MAT2A. La explicación de dicha regulación por la metilación de los promotores y la acetilación32 RESUMEN/SUMMARYde las histonas no explica por completo los cambios entre MAT1A y MAT2A. Además, la conversión de lametionina en SAMe es capaz de regular la tasa de recambio del ARNm de MAT2A.El principal objetivo de este estudio es la identificación de nuevos mecanismos implicados en laproliferación, diferenciación y desdiferenciación de los hepatocitos, la regeneración hepática y latransformación maligna, en relación con SAMe. Nuestra hipótesis consiste en la existencia de una regulaciónpost-transcripcional de los ARNm de MAT1A y MAT2A mediante proteínas de unión al ARN, estabilizando ydesestabilizando dichos ARNm. Nuestros datos indican que la proteína de unión al ARN HuR se une alARNm de MAT2A estabilizándolo, y la proteína de unión al ARN AUF1 se une al ARNm de MAT1Adesestabilizándolo. Asimismo, la metilación de HuR por SAMe cambia su funcionalidad, de forma que se uneal ARNm de MAT2A desestabilizándolo o inhibiendo su traducción. Los niveles de metil-HuR/HuR y AUF1varían durante el desarrollo del hígado, la desdiferenciación de los hepatocitos y la transformación maligna,regulando los niveles de los ARNm de MAT2A y MAT1A. Asimismo, el modelo de ratón GNMT-KO, con unnivel de SAMe elevado crónicamente, presenta una desregulación de MAT2A por metil-HuR/HuR.Como el ratón GNMT-KO presenta desregulación de MAT2A y se caracteriza por altos niveles de SAMe,estudiamos su respuesta regenerativa tras hepatectomía parcial. Encontramos que el ratón GNMT-KOpresenta una alta mortalidad tras la hepatectomía parcial, junto con la inhibición de la ruta LKB1/AMPK/eNOSy de la translocación de HuR al citoplasma, procesos fundamentales para la normal proliferación yregeneración hepática. Además, el bloqueo de la fosforilación de AMPK promueve la activación basal delfactor de transcripción NF¿B junto con la pérdida de la capacidad de activación de NF¿B en respuesta aTNF¿, así como el bloqueo de la expresión de iNOS tras la hepatectomía parcial.De acuerdo con nuestros resultados, la proteína de unión al ARN HuR es fundamental para laproliferación de los hepatocitos, la diferenciación hepática y la transformación maligna. La regulación de sufunción está relacionada con la localización subcelular, la fosforilación, la metilación y su abundanciaproteica. En concreto, su abundancia está regulada por ubiquitinización, pero los mecanismos responsablesde la estabilización de la proteína son desconocidos. El estudio de la regulación de la estabilidad de laproteína HuR en CHC y cáncer de colon nos llevó a descubrir la existencia de una estabilización mediante laNEDDilización de HuR. Mediante el análisis de la abundancia de HuR en líneas celulares de CHC y cáncerde colon y en muestras humanas de CHC y metástasis de colon al hígado, concluimos que Mdm2 NEDDilizaHuR en el citoplasma, promoviendo su localización nuclear y protegiéndolo de la degradación por elproeasoma. El análisis mutacional de la proteína HuR nos permitió localizar las lisinas en las que tiene lugaresta modificación post-traduccional.En conclusión, nuestros resultados descubren un muevo mecanismo de regulación post-transcripcionalde MAT1A y MAT2A, subrayando la importancia de la homeostasis de SAMe en la proliferación,diferenciación y transformación maligna en el hígado. Además, el descubrimiento de un nuevo mecanismo deregulación de la abundancia de HuR en CHC y cáncer de colon a través de la NEDDilización mediada porMdm2, abre nuevas vías para el tratamiento de estas enfermedades.RESUMEN/SUMMARY 33SUMMARYThe chronic liver disease is one of the main causes of mortality in humans. It comprises illnesses withetiologies such as hepatitis B and C virus infection, toxins, alcohol and drugs consumption, autoimmune andhereditary diseases and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). NAFLD is one of the main chronic liverdiseases in developed countries, associated with the metabolic syndrome risk factors (obesity, insulinresistance, dyslipidemia and hypertension), and including alterations from steatosis to non-alcoholicsteatohepatitis (NASH), in some cases accompanied by fibrosis. NAFLD patients of NASH with fibrosis canfinally develop hepatocellular carcinoma (HCC).HCC represents the third leading cause of cancer death globally, and the first cause of death in cirrhoticpatients. HCC is the most prevalent cancer in the population, with a poor prognosis even in the developedcountries. The etiology is diverse, with hepatitis B and C virus, alcoholism, aflatoxin B1 and NAFLD as themain risk factors. Among the molecular factors involved in NAFLD progression to HCC we can find theoxidative stress, the methionine metabolism and the impairment of p53. In particular, several studies haveshown that human patients with liver cirrhosis at a high risk of HCC development present impairment inmethionine metabolism and abnormal S-adenosylmethionine (SAMe) levels.SAMe is the main methyl donor in the cell, being the liver the principal responsible of its homeostasis.SAMe plays a critical role in hepatocyte proliferation, differentiation and tumoral cells apoptosis. In the liverSAMe is able to inhibit the activation of the LKB1/AMPK/eNOS pathway, and avoid the translocation of theRNA binding protein (RBP) HuR, which are important mechanisms for hepatocyte proliferation and liverregeneration. Therefore, SAMe levels must be tightly regulated. The two main enzymes in SAMe synthesisand catabolism are methionine adenosyltransferase (MAT) and glycine N-methyltransferase (GNMT),respectively. The MAT enzymes are codified by two genes, MAT1A and MAT2A. MAT1A encodes for MAT Iand MAT III enzymes, and MAT2A codifies for MAT II. MAT1A is expressed in the adult and differentiatedliver, whereas MAT2A is expressed in fetal and proliferating liver. During liver development, there is a switchfrom MAT2A to MAT1A expression, and during liver de-differentiation, proliferation and malignanttransformation, MAT1A levels decrease together with an increase of MAT2A levels. This regulation of MAT1Aand MAT2A expression is related with promoter methylation and histone acetylation.On the other hand, the SAMe catabolizing enzyme GNMT, is present in large amounts in the liver, andhighly reduced in liver and prostate tumors. Individuals with GNMT mutations spontaneously develop liverdisease. GNMT enzyme regulates the SAMe to SAH ratio, which is considered the index of thetransmethylation potential of the cell. The impairment of this ratio can result into aberrant methylation patterns.In order to study the implications of the impairment of SAMe regulation in the liver, two knockout modelswere developed, MAT1A-KO and GNMT-KO, characterized by chronic deficiency and excess of SAMe levels,respectively. The MAT1A-KO mice present oxidative stress, and develop steatosis and NASH at 8 month, andHCC. The GNMT-KO mice develop steatosis, fibrosis and finally HCC. The observations that both low andhigh SAMe levels lead to similar pathology highlight the importance of the SAMe homeostasis.The regulation of SAMe levels involves MAT1A and MAT2A mRNA expression regulation. The regulationof their expression based on the promoter methylation and histone acetylation does not completely explain thechanges between MAT1A and MAT2A. In addition, methionine conversion into SAMe regulates MAT2AmRNA turnover.The main objective of this study is to identify new mechanisms implicated in the hepatocyte proliferation,differentiation and dedifferentiation, liver regeneration and malignant transformation, in relation with SAMe.We hypothesize that there is a post-transcriptional regulation of MAT1A and MAT2A mRNAs that involveRBPs, which bind to mRNAs stabilizing or destabilizing them. Our data indicate that the RBP HuR binds toMAT2A mRNA stabilizing it, and the RBP AUF1 binds to and destabilizes MAT1A mRNA. Importantly, SAMemethylates HuR promoting MAT2A mRNA destabilization or inhibition of the translation. The levels of methyl-HuR/HuR and AUF1 vary during liver development, hepatocyte de-differentiation and malignant34 RESUMEN/SUMMARYtransformation, thus regulating the levels of MAT2A and MAT1A mRNAs. The knockout mouse model GNMTKO,with chronically elevated SAMe levels, also presents an impairment in MAT2A mRNA regulation bymethyl-HuR/HuR.As the GNMT-KO mice presents dysregulation of MAT2A and is characterized by high SAMe levels, westudied its regenerative response after partial hepatectomy (PH). We found that GNMT-KO mice present highmortality after PH, together with the inhibition of the LKB1/AMPK/eNOS pathway and the translocation of HuRto the cytoplasm, processes fundamental for the normal liver proliferation and regeneration. In addition, theblockade of AMPK phosphorylation promotes NF¿B basal activation and lack of TNF¿-induced NF¿Bactivation and iNOS expression after PH. All these results show the impairment in the liver regeneration of theGNMT-KO mice.The RBP HuR appears, according with our results, as fundamental in the hepatocyte proliferation, liverdifferentiation and malignant transformation processes. The regulation of its function is related with HuRsubcellular localization, phosphorylation, methylation and protein abundance. In particular, HuR abundance isregulated by ubiquitination, but the mechanisms leading to HuR stability are not known. We studied theregulation of HuR protein stability in HCC and colon cancer, and we found that HuR is stabilized byNEDDylation. By studying HuR abundance in HCC and colon cancer cell lines, and in human HCC andmetastatic colon cancer samples, we conclude that Mdm2 NEDDylates HuR in the cytosol, promoting itsnuclear localization and protecting it from the proteasomal degradation. The mutational analysis of HuRprotein allowed us to map the lysines involved in this post-translational modification.In conclusion, our results uncover a new regulatory post-transcriptional mechanism for MAT1A andMAT2A, highlighting the importance of SAMe homeostasis in the proliferation, differentiation and malignanttransformation of the liver. In addition, the finding of a new mechanism for the regulation of HuR abundance inHCC and colon cancer through Mdm2-mediated NEDDylation opens a new field in the treatment of thesemalignancies.