El oncogen MYC como activador transcripcional del receptor del virus de Epstein-Barr (CR2/CD21)

Resumen

Introducción MYC es un factor de transcripción oncogénico que está implicado en gran parte de las funciones celulares. En condiciones fisiológicas se encarga de regular el ciclo celular, la biosíntesis de nucleótidos, metabolismo e incluso procesos de diferenciación y muerte (Conacci-Sorrell et al., 2014; Dang, 1999). Su expresión aberrante provoca alteraciones, principalmente regulando positivamente la división celular y manteniendo un metabolismo activo, lo que conjuntamente deriva en una proliferación sostenida o inmortalización de las células afectadas. Por este motivo MYC es un oncogen altamente conocido y estudiado (Dang, 2012; Schaub et al., 2018; Vita and Henriksson, 2006). En linfomas y leucemias MYC es uno de los genes que se encuentra alterado con más frecuencia, generalmente translocado, lo que produce que se sobreexprese. En linfoma de Burkitt, se encuentra sobreexpresado en más del 90% de los casos estudiados hasta la fecha (Said et al., 2014). Hay dos variantes principales: el linfoma de Burkitt endémico y el esporádico que difieren en distribución geográfica, población de riesgo afectada e incidencia, a pesar de que las características histopatológicas y las anormalidades genéticas presentadas son muy similares (Magrath, 2012; Schmitz et al., 2014). Además, difieren en el porcentaje de casos relacionados con la infección por Eptein-Barr (EBV). El EBV es un herpesvirus con afinidad por los linfocitos B. Tras una primera infección asintomática, puede permanecer en letargo durante años. Se cree que aproximadamente un 90% de la población adulta está infectada con este virus. El EBV entra dentro de su célula diana a través de un receptor de los linfocitos B, la proteína CD21 o CR2 (Thorley-Lawson et al., 2013). Aunque la translocación de MYC y la infección por EBV son dos alteraciones que contribuyen al desarrollo de esta enfermedad, aún no se sabe si existe alguna relación entre ambas o, si existe, cual es esa relación. La hipótesis más apoyada hasta ahora, es que la infección por el EBV y la expresión de los genes virales, podría provocar alteraciones en el genoma que podrían desencadenar la translocación de MYC y finalmente su sobreexpresión, generando una proliferación sostenida de los linfocitos B (Asokan et al., 2013; Yustein and Dang, 2007; Zabel and Weis, 2001). Resultados del proyecto El modelo de estudio que se ha utilizado principalmente es una línea de linfoma de Burkitt, EBV positiva denominada Raji. El tratamiento de estas células con JQ1 (inhibidor de proteínas con bromodominios) regula negativamente la expresión de MYC. Tras el silenciamiento de MYC debido al tratamiento con JQ1 observamos igualmente una bajada en los niveles de CR2 a nivel de RNA mensajero (mRNA) y proteína. Quisimos descartar que la bajada de CR2 se debiera a un efecto indirecto de la parada proliferativa. Para ello, realizamos dos experimentos: utilizamos las KMycJ, y las pre-tratamos con TPA para inducir una parada proliferativa. Por otro lado, también utilizamos la línea celular Kp27MER. Al sobreexpresar p27 en estas células se produce una para de ciclo inducida por p27 que no se recupera tras la activación de la proteína quimérica MYC-ER. Sin embargo, al igual que en el experimento anterior los niveles de mRNA de CR2 aumentaron tras la activación de la proteína MYC-ER, aunque las células mantienen la parada de ciclo. Por lo tanto, podemos concluir que la regulación de CR2 por MYC no es dependiente del estado proliferativo de las células. Por otro lado, tratamos las células KMER4 con cicloheximida y 4HT. Observamos que la activación de la proteína MYC-ER aumenta la expresión de CR2 a nivel de mRNA, incluso en ausencia de síntesis de proteínas. Estos datos sugieren que MYC induce directamente la expresión de CR2. Para determinar la unión directa de MYC al promotor de CR2, transfectamos diferentes construcciones del promotor de CR2 dentro de vectores luciferasa en las células Raji y observamos que la actividad del promotor disminuía tras el silenciamiento de MYC. Además, realizamos un ChIP de MYC en células Raji, observando que existe un enriquecimiento de MYC en la región proximal del promotor de CR2, confirmando así los resultados observados en la base de datos ENCODE para otras líneas celulares como K562. Tomados en su conjunto, todos estos datos confirman que CR2 es una diana directa de MYC. Por último, decidimos infectar una línea celular de linfoma de Burkitt Epstein-Barr negativa (Ramos) con virus de Epstein-Barr. Los resultados sugieren que existe una correlación entre los bajos niveles de MYC y CR2, con una reducida eficiencia de la infección por EBV. También se estudió el papel de CR2 en la fisiología de la línea celular Raji infectándola con partículas lentivirales que contenían un shRNA contra CR2. Se realizaron ensayos de proliferación celular y muerte. Además, se estudiaron diferentes vías susceptibles de ser alteradas por la deficiencia en CR2. Tan sólo han podido observarse cambios en la fosforilación de ERK, aunque quedaría por determinar si la bajada en la fosforilación de ERK es un efecto directo del silenciamiento de CR2 o podría deberse a una regulación de ERK por una vía diferente a la vía directa de las MAP kinasas. Conclusiones 1. La regulación negativa de MYC en líneas derivadas de células B y T, mediada tanto por JQ1 como por shRNAs, provocan una bajada proporcional en los niveles de CR2. 2. La sobreexpresión de MYC en líneas celulares derivadas de K562 indujo la expresión de mRNA de CR2 en células en arresto proliferativo. Por tanto, la inducción de CR2 por MYC es independiente del estado proliferativo de las células. 3. En condiciones de ausencia de síntesis de proteínas, MYC es capaz de inducir la expresión de mRNA de CR2. 4. El ChIP realizado en las Raji sugiere que MYC se une a lo largo del promotor del CR2. MYC activa el promotor de CR2 de manera dependiente de la presencia de cajas E. Por tanto, MYC regula directamente el promotor de CR2, activando su transcripción. 5. El silenciamiento de CR2 con shRNA provoca una bajada proliferativa y la inactivación de ERK2 sugiriendo que la inactivación de la vía de las MAP kinasas podría ser la vía a través de la cual la bajada de CR2 provoca una parada proliferativa. 6. La bajada en los niveles de expresión de MYC y, por tanto, del receptor del virus, provoca una bajada en la eficiencia de la infección de EBV en células B humanas. 7. La translocación de MYC podría ser el mecanismo a través del cual aumentaran los niveles del receptor del EBV y, por tanto, favoreciera la infección de los linfocitos B y, en última instancia, inducir la transformación de estas células. 8. Esta hipótesis estaría más en consonancia con el subtipo de linfoma de Burkitt esporádico, en el que la asociación del virus con esta enfermedad ocurre en un 20-30% de los casos. Bibliografía Asokan, R., Banda, N.K., Szakonyi, G., Chen, X.S., and Holers, V.M. (2013). Human complement receptor 2 (CR2/CD21) as a receptor for DNA: implications for its roles in the immune response and the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE). Mol Immunol 53, 99-110. Conacci-Sorrell, M., McFerrin, L., and Eisenman, R.N. (2014). An overview of MYC and its interactome. Cold Spring Harb Perspect Med 4, a014357. Dang, C.V. (1999). c-Myc target genes involved in cell growth, apoptosis, and metabolism. Mol Cell Biol 19, 1-11. Dang, C.V. (2012). MYC on the path to cancer. Cell 149, 22-35. Magrath, I. (2012). Epidemiology: clues to the pathogenesis of Burkitt lymphoma. Br J Haematol 156, 744-756. Said, J., Lones, M., and Yea, S. (2014). Burkitt lymphoma and MYC: what else is new? Adv Anat Pathol 21, 160-165. Schaub, F.X., Dhankani, V., Berger, A.C., Trivedi, M., Richardson, A.B., Shaw, R., Zhao, W., Zhang, X., Ventura, A., Liu, Y., et al. (2018). Pan-cancer Alterations of the MYC Oncogene and Its Proximal Network across the Cancer Genome Atlas. Cell Syst 6, 282-300 e282. Schmitz, R., Ceribelli, M., Pittaluga, S., Wright, G., and Staudt, L.M. (2014). Oncogenic mechanisms in Burkitt lymphoma. Cold Spring Harb Perspect Med 4. Thorley-Lawson, D.A., Hawkins, J.B., Tracy, S.I., and Shapiro, M. (2013). The pathogenesis of Epstein-Barr virus persistent infection. Curr Opin Virol 3, 227-232. Vita, M., and Henriksson, M. (2006). The Myc oncoprotein as a therapeutic target for human cancer. Semin Cancer Biol 16, 318-330. Yustein, J.T., and Dang, C.V. (2007). Biology and treatment of Burkitt's lymphoma. Curr Opin Hematol 14, 375-381. Zabel, M.D., and Weis, J.H. (2001). Cell-specific regulation of the CD21 gene. Int Immunopharmacol 1, 483-493.