Las proteínas multifuncionales ctcf y boris en la regulación del dna ribosomal y en la epidermis humana

Resumen

CTCF es una proteína nuclear, expresada ubícuamente y altamente conservada a lo largo de la evolución desde Drosophila a humanos. Estructuralmente CTCF presenta un dominio central constituido por once dedos de zinc, con los cuales es capaz de interaccionar, tanto con el DNA, como con otras proteínas. Posee además extremos N-terminal y C-terminal desestructurados, este último susceptible de ser fosforilado. CTCF puede ser también modificada post-transcripcionalmente tanto por sumoilación como por poli(ADP)ribosilación, modificaciones que regulan sus funciones. Gracias a la capacidad unirse a secuencias de DNA muy diversas, a CTCF se le considera un factor multivalente de manera que, aunque fue descrito inicialmente como represor transcripcional del oncogen c-MYC, con el tiempo se le han ido atribuyendo numerosas funciones. Entre ellas están las de activador y represor transcripcional de numerosos genes implicados en el ciclo celular, o la de aislante de la cromatina, dentro de la cual puede funcionar impidiendo el avance de la heterocromatina o como bloqueador de proteínas amplificadoras, influyendo en la expresión de genes que pueden estar a situados a grandes distancias. CTCF está además implicado en numerosos procesos como en la regulación de la expansión de tripletes, importante en numerosos desordenes neurológicos, en la inactivación del cromosoma X y en el desarrollo de diversos tumores, como el de mama, próstata o el de Wilms, a causa de mutaciones puntuales de alguno de sus once dedos de zinc o por anomalías cromosómicas en el locus humano donde mapea CTCF. Por todo ello actualmente se ha propuesto a CTCF como un maestro tejedor del genoma, implicado de una manera muy importante tanto en la organización como en la regulación global de la cromatina. Recientemente ha sido caracterizado un parálogo de CTCF que presenta una alta homología en la región central de unión al DNA de los dedos de zinc, pero con secuencias diferentes tanto en el extremo N- como en el C-terminal, a consecuencia de lo cual se cree que podría presentar el mismo potencial de interacción que CTCF pero con distinta actividad. Esta proteína se ha denominado BORIS o CTCFL y su expresión hasta ahora tan solo ha sido descrita en ciertas células del testículo donde parece que desempeña una importante labor en la reprogramación de su patrón de metilación. Este característico patrón de expresión, junto al hecho de que CTCF y BORIS presentan una alta homología para la región central de los dedos de zinc, ha hecho que recientemente se haya propuesto un modelo de actuación en el que ambos pueden estar desempeñando actividades opuestas. BORIS se expresa además de forma aberrante en numerosas líneas derivadas de tumores y en multitud de cánceres, habiendo sido incluso propuesto como un marcador temprano del cáncer de mama. Sin embargo, las funciones biológicas de BORIS aún no están tan bien conocidas como las de CTCF y son, por tanto, un campo en constante exploración. Resultados previos de nuestro grupo mostraron la localización nucleolar de CTCF en respuesta a diferentes estímulos (Torrano et al., 2006). Además su sobreexpresión inhibía la transcripción nucleolar y el dominio de unión al DNA de CTCF era el responsable de su translocación al nucleolo. Todo ello sugería un posible papel en la regulación del DNA ribosomal (rDNA). Por tanto, uno de los objetivos del presente estudio fue analizar el papel que desempeña CTCF en la regulación del rDNA, región del genoma que codifica para las distintas subunidades de rRNA, componentes estructurales del ribosoma, un orgánulo vital para el crecimiento y desarrollo de la célula. Para ello caracterizamos, a través ensayos de movilidad electroforética (EMSA) e inmunoprecipitación de cromatina, la unión tanto de CTCF como de su parálogo BORIS a dos regiones del rDNA (denominamos H37.9 y H42.1) localizadas en la región intergénica espaciadora en 5' del promotor. Se ha demostrado además que la unión de CTCF a dichas regiones es dependiente de metilación, de manera que CTCF es capaz de unirse a ellas únicamente cuando no están metiladas. Para intentar profundizar en la actividad que puede estar llevando a cabo CTCF en dichas regiones del rDNA estudiamos también la relación que existe entre CTCF y otra proteína fundamental en la transcripción del rDNA denominada UBF. UBF es una proteína muy importante en la regulación ribosomal ya que se encarga de formar el complejo pre-transcripcional al que posteriormente se unirá la RNA-polimerasa I, encargada de la transcripción de los genes ribosomales. Trabajos previos llevados a cabo en el laboratorio del Dr. Niels Galjart demostraban la existencia de una interacción directa entre CTCF y UBF, de manera que mediante ensayos de co-inmunoprecipitación logramos confirmar dichos resultados, demostrando que dicha interacción se lleva a cabo mediante la región ZF de CTCF. Posteriormente y mediante el uso de técnicas de EMSA y de ChIP -reChIP (ensayo secuencial de inmunoprecipitación de cromatina) demostramos también que ambas proteínas son capaces de unirse simultáneamente tanto a la región H37.9 como a la H42.1 del rDNA, lo que sugiere que ambas proteínas están interaccionando entre si en un complejo regulador del rDNA. Finalmente y para intentar determinar la relevancia funcional de CTCF en la regulación de la cromatina llevamos a cabo un análisis de distintas marcas de histonas a lo largo del rDNA que demuestran que CTCF ejerce un papel regulador de la transcripción nucleolar. Así pues, nuestra actual hipótesis de trabajo es que CTCF es la proteína encargada de anclar a UBF en los sitios H37.9 y H42.1 del rDNA y que además, la unión de CTCF en estos dos sitios situados aguas arriba del promotor, y cercanos al punto de inicio de la transcripción, es esencial para la organización local de la cromatina y la apropiada transcripción de los genes ribosomales. El segundo de los objetivos que se ha desarrollado en esta Tesis ha sido la caracterización del patrón de expresión y las funciones de CTCF y de su parálogo BORIS tanto en epidermis humana como en queratinocitos humanos primarios en cultivo. Esta investigación surgió como consecuencia de la detección en piel de RNA mensajeros, tanto de CTCF como de BORIS, mediante experimentos de RT-PCR llevados a cabo en diversos órganos de ratón. Posteriormente esta expresión fue analizada mediante ensayos de inmunofluorescencia y corroborada tanto en cortes histológicos de piel humana como en cultivos primarios de queratinocitos. La piel es un excelente modelo para estudiar diferenciación celular, ya que es un epitelio estratificado y autorenovable, que presenta una capa basal de células proliferativas, a partir de la cual comienza la diferenciación, que llega a ser total en capas suprabasales. Los cambios morfogenéticos asociados con esta estratificación son bastante conocidos, pero no así los mecanismos moleculares que la orquestan. Esto, junto al hecho de que la piel es un tejido con alta homología, tanto estructural como funcional, con el único tejido en el que por ahora se ha descrito expresión de BORIS en condiciones no tumorales, el testículo, nos hizo tomar la decisión de utilizar la piel como modelo para dicho estudio. El uso de ensayos de inmunofluorescencia para CTCF y BORIS corroboraron la aparición de ambas proteínas en epidermis, mostrando un patrón de expresión bastante homogénea tanto de CTCF como de BORIS a lo largo de todas las capas, aunque hay que puntualizar que la expresión de CTCF parece disminuir en capas más diferenciadas de la piel. En ensayos posteriores en los que se utilizaron distintos marcadores, se logró identificar las estructuras celulares donde se localizaban estas proteínas. Mientras que la expresión de CTCF aparece ser nucleoplasmática, con distribución eventualmente en nucleolo, la de BORIS es fundamentalmente nucleolar, lo que corrobora nuestros resultados de ChIP en los que detectábamos unión de BORIS al rDNA. BORIS además se localiza en los centrosomas durante interfase, lo que se complementa con resultados publicados por otro grupo donde se describe la expresión de CTCF en el centrosoma durante metafase pero no en interfase, sugiriendo por tanto que CTCF y BORIS pueden están llevando a cabo distintas funciones en dicho orgánulo de manera dependiente del ciclo celular. Este patrón de expresión ha sido corroborado mediante ensayos de inmunofluorescencia en numerosas líneas celulares humanas y además la acumulación nucleolar de BORIS ha sido también demostrada mediante la transfección de células 293T con una construcción que codifica la proteína BORIS fusionada con la proteína verde fluorescente (GFP) sugiriendo que este patrón de expresión es generalizado. Por ultimo cabe también destacar la distinta localización que se ha detectado durante los experimentos de transfección entre la construcción para el BORIS humano y la de ratón. Así, mientras la primera se localiza principalmente en el nucleolo, la de ratón aparece principalmente localizada en el citoplasma. El alineamiento de las secuencias aminoacídicas de ambas proteínas indican que aunque existe una alta homología en la región central, tanto el dominio C-terminal como el N-terminal son diferentes, lo que hace pensar que probablemente las proteínas con las que son capaces de interaccionar son diferentes, pudiendo ser dichas interacciones decisivas para la localización. Serán necesarios más experimentos en el futuro para intentar demostrar esta hipótesis. En resumen, este trabajo aporta nuevos conocimientos sobre las funciones de las proteínas de la familia CTCF, importantes reguladores génicos implicados en cáncer.