El eje Myc-Cdk1-p27 en proliferación y control de la diferenciación

Resumen

1. Introducción El factor de transcripción c-MYC (MYC de aquí en adelante) pertenece a la familia de proteínas MYC junto con otros dos miembros: N-MYC y L-MYC. En general, MYC presenta localización nuclear, una vida media corta y su expresión se relaciona con procesos de proliferación y estados de indiferenciación celular, mientras que la bajada de su expresión está asociada a parada proliferativa y procesos de diferenciación (Grandori et al., 2000). El gen MYC se localiza en locus 8q24.21 en humanos y codifica una proteína de 64 kDa (la isoforma mayoritaria) compuesta por 439 aminoácidos (Hann and Eisenman, 1984; Persson et al., 1984). Fue el primer factor de transcripción descrito en presentar actividad oncogénica. Desde su descubrimiento ha estado asociado a translocaciones cromosómicas que tenían lugar en diferentes enfermedades, como en Linfoma de Burkitt, plasmacitomas o inmunocitomas (en humanos, ratón y rata respectivamente)(Crews et al., 1982; Dalla-Favera et al., 1982; Sumegi et al., 1983; Taub et al., 1982). A partir de entonces, y hasta la fecha, se ha visto que MYC se encuentra desregulado en aproximadamente el 70% de los canceres humanos. La sobreexpresión de MYC encontrada en diferentes tumores viene dada por translocaciones cromosómicas, amplificación génica o infecciones virales. Sin embargo, la mayoría de los tumores presentan una desregulación de MYCa nivel transcripcional que resulta en un incremento de sus niveles de ARN mensajero, cuyo mecanismo aún se desconoce, y que probablemente sea debido a alteraciones en las rutas de señalización encargadas de la regulación de la expresión de MYC a nivel de su promotor. Debido a que la actividad de MYC está estrechamente ligada a su estabilidad proteica, alteraciones en las vías de degradación de MYC, así como de modificadores postraduccionales que modulan su vida media, también se relacionan con diferentes procesos tumorales(Dang, 2012). La proteína MYC presenta diferentes dominios implicados principalmente en la interacción con complejos proteicos a través de los cuales MYC realiza su función reguladora de la expresión génica. En primer lugar, MYC presenta en su extremo C-terminal el dominio b-HLH-LZ (dominio básico hélice-lazo-hélice cremallera de leucinas) a través del cual es capaz de interaccionar con otras proteínas y unirse al ADN. Por otro lado, en su extremo N terminal, se encuentra el TAD (dominio de transactivación) que contiene dos MB (cajas MYC): MBI y MBII. Este dominio es importante ya que es a través del cual MYC recluta complejos HAT (histona acetil-transferasas) para activar la transcripción de gran parte de sus genes diana. En su zona central, MYC presenta otras dos MB: MBIII y MBIV. Esta región es importante para los procesos de represión génica, ya que la MBIII está implicada en la interacción con complejos HDACs (histona deacetilasas). MYC también presenta una secuencia de localización nuclear (NLS) y una secuencia PEST. A través de esta última, MYC es proteolizado, dando lugar a la proteína conocida como MYC-nick, que carece del dominio C terminal de la proteína MYC original.Presenta localización citoplasmática y ha se visto implicada en procesos de regulación de microtúbulos(Conacci-Sorrell et al., 2010; Hann, 2014). Para llevar a cabo su actividad como regulador transcripcional, MYC ha de interaccionar con MAX, otra proteína perteneciente a la familia de factores de transcripción que presentan en común el dominio b-HLH-LZ. MYC y MAX interaccionan por sus respectivos dominios H-LZ (segunda hélice y cremallera de leucinas), mientras que reconocen y se unen al ADN a través de la región b-H (región básica y primera hélice). Reconocen el ADN en secuencias consenso en las regiones promotoras de los genes a los que regulan, conocidas como cajas-E (CACGTG)(Grandori et al., 2000). Está descrito que MYC regula aproximadamente el 10-15% del genoma, y que se une a aproximadamente 5000 loci. MYC activa la expresión del 50% y reprime la del otro 50% de sus genes diana. En general, el mecanismo por el cual MYC activa la transcripción génica es bastante conocido. A través del TAD, MYC recluta complejos HAT, principalmente utilizando la proteína adaptadora TRRAP como “andamio”. Los principales complejos HAT reclutados por TRRAP son GCN5 y TIP60. Por otro lado, MYC interacciona con CBP/p300 independientemente de TRRAP, otro complejo con actividad acetil-transferasa. A través de estos complejos, MYC es capaz de activar la expresión de sus genes diana acetilando la cromatina, favoreciendo así el proceso de transcripción (Grandori et al., 2000). Por otro lado, MYC es considerado como un amplificador global de la transcripción. Su sobreexpresión se asocia con un incremento de la cantidad total de RNA en la célula. Una de las pruebas que soportan esta teoría, es la función de MYC como “liberador de la pausa” de la RNA pol II. Se ha descrito que MYC se une a la cromatina en regiones que se encuentran parcialmente activas, donde previamente se ha unido la RNA pol II. MYC recluta el complejo p-TEFb induciendo así la fosforilación del CTD de la RNA pol II en la Ser5 y Ser2, lo que da lugar al inicio y elongación de la transcipción génica(Lin et al., 2012; Nie et al., 2012). En cuanto al mecanismo a través del cual MYC reprime sus genes diana, es mucho menos conocido que el anterior. Se sabe que MYC es capaz de reclutar HDACs o DNMTs (ADN metil-transferasas), por sí mismo o a través de otros complejos, dando lugar a la deacetilación de la cromatina y la metilación del DNA, principalmente en islas CpG, lo cual se relaciona con marcas de cromatina inactiva. Además, se ha descrito que MYC es capaz de reprimir la expresión génica interaccionando con MIZ-1 o SP1 a través de secuencias Inr (Iniciadoras) localizadas al inicio de la transcipción de ciertos genes(Herkert and Eilers, 2010). Debido a su gran cantidad de genes diana, MYC se encuentra implicado en la regulación de muchas funciones celulares, como son: proliferación y ciclo celular, crecimiento celular y biosíntesis de proteínas, metabolismo energético, mantenimiento del estado de indiferenciación celular, modificador de la cromatina, apoptosis y senescencia entre otros. Por este mismo motivo, su desregulación da lugar a procesos tumorales, de los cuales MYC se ha visto implicado en: inmortalización celular, inestabilidad genómica, inflamación y angiogénesis, metástasis, mantenimiento de un estado proliferativo constante o evasión de supresores de crecimiento. MYC forma parte de la red de proteínas MYC/MAX/MXD. La familia de proteínas MXD, compuesta por MXD1, MXI1, MXD3, MXD4 y MNT, pertenecen también al conjunto de factores de transcripción que contienen el dominio b-HLH-LZ, y compiten con MYC por su interacción con MAX y la unión a las cajas E en el ADN. Además, todas ellas comparten una secuencia conservada conocida como SID (dominio de interacción con mSin3). A través del SID, las proteínas MXD reclutan complejos HDAC encargados de la represión de sus genes diana. Son considerados antagonistas de MYC y, en general, se relacionan con estados celulares quiescentes y de diferenciación, aunque con ciertas excepciones. Por ejemplo, MNT se expresa de forma constitutiva tanto en células activamente proliferativas como quiescentes, o MXD3, expresado durante la fase S del ciclo celular(Grandori et al., 2000). De entre todas las funciones de MYC, a lo largo del trabajo de esta Tesis Doctoral, nos hemos centrado en dos de ellas: la regulación del ciclo celular y el papel de MYC en la diferenciación eritroide. El ciclo celular, proceso por el cual una célula crece en tamaño, duplica su conenido y da lugar a dos células hijas idénticas entre sí, es un proceso altamente conservado y regulado. Su principal regulación está a cargo de los denominados complejos ciclina-CDK. Estos complejos desenlazan una serie de cascadas de fosforilación que promueven la transición de una fase a otra del ciclo. Las CDKs (quinasas dependientes de ciclina) presentan una expresión constante a lo largo del ciclo y requieren de una subunidad reguladora, la ciclina, para ser activas. Las ciclinas, como su nombre indica, presentan un patrón de expresión transitorio dependiente de la fase del ciclo en la cual se encuentra la célula. En una célula que se encuentra parada en fase G0/G1, tras recibir una señal mitogénica, los complejos ciclina D-CDK4/6 son activados, encargados de fosforilar parcialmente Rb, que mantiene inactivo el factor de transcripción E2F, dando lugar a la expresión de ciertos genes, entre ellos, ciclina E. La expresión de ciclina E induce la activación de los complejos ciclina E-CDK2 al final de la fase G1, los cuales se encargan de hiperfosforilar a Rb, activando totalmente E2F, el cual inducirá la expresión de genes de fase S, implicados en la replicación del ADN. Entre ellos, E2F induce la expresión de ciclina A, la cual pasará a formar complejos activos con CDK2 necesarios para el correcto paso a través de la fase S. Durante la fase G2, los complejos ciclin A-CDK2 son reemplazados por complejos ciclina A-CDK1. Finalmente, y durante la fase M (Mitosis) se activarán los complejos ciclina B-CDK1, encargados de regular el paso a través de la fase M y el proceso de separación de las dos células hijas. Tanto las ciclinas como las CDKs presentan funciones redundantes, que han sido descritas mediante el estudio de una gran variedad de modelos de ratones knock out para todos estos genes, de forma individual o en conjunto. Finalmente, se ha descrito que sólo CDK1 es indispensable para la progresión a través de las diferentes fases del ciclo, y que las únicas ciclinas que no presentan redundancia en sus funciones son ciclina A2 y ciclina B1(Santamaria et al., 2007). A su vez, la actividad de los complejos ciclina-CDK se encuentra regulada por los denominados inhibidores de CDK (CKIs). Los CKIs consisten en dos familias de proteínas: la familia INK4, formada por p15, p16, p18 y p19, encargada de regular la actividad de los complejos ciclina D-CDK4/6; y la familia CIP/KIP, formada por p21, p27 y p57, que se encargan de regular la actividad de los complejos ciclina E-CDK2, ciclina A-CDK2 y ciclina B-CDK1. Un gran porcentaje de los genes regulados por MYC están implicados en la regulación del ciclo celular, en procesos como la inducción de la actividad de las CDKs, en los procesos de replicación del ADN, en mitosis, y en la regulación de los CKIs. Entre los procesos de regulación de los CKIs, es de especial interés la correlación opuesta que existe entre los niveles de MYC y de p27 en células proliferantes. De hecho, existen gran cantidad de tumores humanos en los que se ha encontrado una correlación entre altos niveles de expresión de MYC y bajos niveles de p27, una marca que se considera de mal pronóstico de la enfermedad. El principal efecto inhibitorio de p27 recae sobre los complejos ciclina E-CDK2, provocando una parada proliferativa en G1. Para que la célula pueda progresar de G1 a fase S, es necesario que los niveles de p27 en la célula se vean reducidos. La principal vía de degradación de p27 en la célula tiene lugar a través del complejo SCFSKP2 vía proteasoma. SKP2 es la ubiquitin ligasa del complejo SCF encargada de reconocer y ubiquitilar p27 para que sea degradado. Este reconocimiento por SKP2 es dependiente de la fosforilación de p27 en la Thr187. La quinasa encargada de fosforilar p27 en la Thr187 es ciclina E/A-CDK2. Una de las principales funciones de MYC como potente activador de la entrada en fase S consiste en la inducción de la degradación de p27 a través de esta vía. Se sabe que MYC induce la expresión de ciclina E, directamente sobre su promotor o indirectamente a través de la regulación de E2F. También se ha descrito que SKP2 es un gen diana de MYC. De esta forma, MYC activa los complejos ciclina E-CDK2 encargados de fosforilar a p27 en la Thr187, así como la expresión de SKP2, encargado de ubiquitilar a p27 para su posterior degradación vía proteasoma(Bretones et al., 2015). En la segunda parte de esta Tesis Doctoral nos hemos centrado en la regulación de la eritropoiesis por MYC, ya que resultados previos en nuestro laboratorio y en la literatura sugieren que MYC presenta un papel importante en la regulación de este proceso. La eritropoiesis es el proceso a través del cual se producen los eritrocitos (glóbulos rojos). Se trata de un proceso muy dinámico y regulado, y de gran importancia debido a su función como transportadores de oxígeno a todo el organismo. De hecho, el requerimiento de un organismo adulto es de una producción de 2 x 1011 eritrocitos diarios. El proceso de diferenciación para la formación de eritrocitos en un organismo adulto comienza en la médula ósea, donde las células madre hematopoiéticas (LT-HSC) responden a una serie de señales intracelulares y extracelulares que inducen su proliferación y diferenciación hacia progenitores multipotentes (MMPs). Estos MMPs pueden dar lugar a CMPs (progenitores comunes mieloides) o CLPs (progenitores comunes linfoides). Estos CMPs diferencian después hacia MEPs (progenitores megacariocíticos-eritroides) proceso en el cual son de gran importancia ciertas citoquinas tales como: SCF, TPO, GM-CSF-IL3 o IL11. Los MEPs dan lugar a BFU-e, y éstos a CFU-e, ambos considerados como unidades formadoras de colonias (más pequeñas y diferenciadas las segundas que las primeras) que contienen células hemoglobinizadas. A partir de las CFU-e y en presencia de EPO, los precursores eritroides pasan por una serie de procesos de maduración en los que pierden todo su contenido celular, hasta que finalmente pierden el núcleo, momento en el que entran en el torrente sanguíneo como reticulocitos, y donde sufren el último proceso de maduración dando lugar a los eritrocitos. Todo este proceso está altamente regulado y controlado no sólo por citoquinas, sino también por marcadores eritroides y factores de transcripción específicos, entre ellos GATA1, NFE2 o KLF1(Dzierzak and Philipsen, 2013). Una de las primeras actividades biológicas descritas para MYC fue la inhibición de la diferenciación. En primer lugar, se describió que MYC bloqueaba la diferenciación eritroide en una línea celular murina de eritroleucemia, así como la inhibición del desarrollo de linfocitos B en ratones transgénicos Eµ-myc previa al linfoma. Desde entonces, se ha observado que la expresión ectópica de MYC inhibe la diferenciación en varias líneas celulares y en células primarias. Además se ha puesto de manifiesto la importancia de la inhibición de la diferenciación en la tumorogénesis inducida por MYC en modelos transgénicos de ratón con expresión constitutiva de MYC en los cuales la inactivación de MYC induce regresión tumoral asociada a un proceso de rediferenciación de las células tumorales(Delgado and Leon, 2010; Leon et al., 2009). 2.Objetivos 2.1. El eje MYC-CDK1-p27 Existe un antagonismo funcional entre el inhibidor de ciclo celular p27 y el factor de transcripción MYC. De hecho, esta correlación inversa se ha encontrado en un gran número de tumores humanos, y se considera como marca de mal pronóstico de la enfermedad. Se ha descrito que MYC induce degradación de p27 activando complejos ciclina E-CDK2 y la expresión de SKP2, ambos implicados en la principal vía de degradación de p27. Esta degradación a través de SKP2 depende de la fosforilación de p27 en la Thr187. La cual es mediada por CDK2. Sin embargo, estudios previos en nuestro laboratorio han sugerido que MYC es capaz de inducir fosforilación de p27 independiente de CDK2. De acuerdo con los resultados previos descritos, nos planteamos los siguientes objetivos para la primera parte de esta Tesos Doctoral: 1. Determinar el mecanismo por el cual MYC induce proliferación en ausencia de complejos ciclina E-CDK2. 2. Demostrar qué CDK, además de CDK2, es inducida por MYC para fosforilar a p27. 3. Determinar si MYC es capaz de inducir degradación de p27 a través de dicho complejo ciclina-CDK y el SCFSKP2. 7.2.2. El papel de MYC en la diferenciación eritroide. MYC juega un papel muy importante durante los procesos de diferenciación celular, especialmente en la hematopoiesis. Este papel está estrechamente relacionado con la habilidad de MYC de inducir proliferación y mantener el estado de indiferenciación celular. En nuestro laboratorio se ha demostrado que la expresión ectópica de MYC inhibía la diferenciación inducida por diferentes drogas en la línea leucémica mieloide K562. Además, en el proceso de diferenciación eritroide inducido por p27 en células K562, MYC era capaz de inhibir el proceso de diferenciación sin revertir el estado de arresto proliferativo causado por p27. En todos los casos en los que se observaba diferenciación eritroide en K562, las células sufrían una parada proliferativa y una baja de la expresión de MYC. De acuerdo con los resultados previos descritos, nos planteamos los siguientes objetivos para la segunda parte de esta tesis Doctoral: 1. Determinar si la bajada de los niveles de MYC es suficiente para inducir diferenciación eritroide en K562. 2. Determinar si las proteínas MXD son necesarias durante el proceso de diferenciación eritroide inducida tras la bajada de la expresión de MYC. 3. Determinar si la diferenciación eritroide inducida por la bajada de la expresión de MYC es dependiente de la parada proliferativa. 3.Resultados y discusión 3.1. El eje MYC-CDK1-p27 Resultados previos en nuestro laboratorio habían demostrado que MYC era capaz de inducir proliferación en células knock out para cdk2 y ciclina E. Además, también se había visto que MYC era capaz de inducir fosforilación de p27 en la Thr187 en ausencia de actividad quinasa de CDK2, posiblemente a través de complejos CDK1. Por tanto, decidimos estudiar el mecanismo por el cual MYC inducía proliferación en ausencia de complejos ciclina E-CDK2, y si era capaz de promover la degradación de p27 a través de la activación de complejos CDK1. En primer lugar, trabajamos con la línea celular de fibroblastos de ratón deficientes en CDK2 (cdk2-/- MEFs) infectadas con partículas lentivirales que contenían un vector de sobreexpresión de MYC (MYC-IRES-GFP) o su respectivo control. Observamos que la sobreexpresión de MYC en estas células inducía la expresión de CDK1, CDK4, ciclina A2, ciclina E y ciclina B1, así como los niveles de fosforilación de Rb (Fig. 4.1 A-C), todo ello de acuerdo con los resultados previos obtenidos en las curvas de proliferación. Posteriormente, decidimos analizar los niveles de p27 y de SKP2 en los cdk2-/-MEFs bajo condiciones de sobreexpresión de MYC. Para ello utilizamos una línea estable de cdk2-/--MER MEFs en la que la proteína quimérica MYC-ER es activable por tamoxifeno (4HT). Deprivamos las células de suero para ver acumulación de p27 y efecto en la activación de MYC-ER, y observamos que la activación de MYC con 4HT fue acompañada por un incremento en los niveles de SKP2 y una bajada en p27 (Fig. 4.2A). Además, para comparar los niveles de estabilidad de p27 en cdk2-/- MEFs control o aquellos que sobreexpresan MYC, hicimos una cinética de degradación tratando las células con cicloheximida (inhibidor de la síntesis de proteínas) a tiempos cortos. Observamos que tras el tratamiento, los cdk2-/- MYC MEFs mostraron un incremento en la velocidad de degradación de p27 comparados con sus controles respectivos (Figs. 4.2B,C). Todo esto sugiere que, en ausencia de CDK2, MYC es capaz de inducir actividad ciclina-CDK, fosforilación de Rb, inducción de la expresión de SKP2 y degradación de p27. Además, debido a que CDK1 era el principal candidato para compensar la falta de CDK2, y que forma complejos activos con ciclina A2, decidimos estudiar la interacción de p27 con los complejos ciclina A2-CDK1. Transfectamos los cdk2-/- MYC MEFs y los cdk2-/-control MEFs con un vector de sobreexpresión de p27 e imunoprecipitamos con un anticuerpo anti-p27. Observamos que p27 era capaz de interaccionar con ciclina A2 y CDK1 en ausencia de CDK2 (Figs. 4.2D,E). De acuerdo con este resultado, MYC podría estar induciendo la fosforilación de p27 en la Thr187 a través de la activación de complejos CDK1, para su posterior degradación vía proteasoma. Previamente ensayamos la interacción de CDK1 con ciclina E en estas células y no observamos interacción. Este resultado era consistente con observado por Ortega y colaboradores, quienes tampoco observaban interacción de ciclina E con CDK1. Para verificar nuestra hipótesis por la cual postulábamos que MYC inducía fosforilación de p27 en la Thr187 a través de complejos CDK1, realizamos ensayos quinasa in vitro con complejos CDK1 obtenidos de extractos proteicos de cdk2-/-MYC MEFs y de su respectivo control, utilizando His-p27 recombinante como sustrato. Observamos que la sobreexpresión de MYC inducía la actividad quinasa de CDK1 y que el tratamiento de dichos inmunocomplejos con Purvalanol A (un potente inhibidor de CDK1) previo al ensayo quinasa in vitro, reducía drásticamente su actividad quinasa (Fig. 4.3A,B). Por tanto, estos resultados nos indican que MYC es capaz de inducir fosforilación de p27 a través de complejos CDK1. Previos resultados en nuestro laboratorio habían sugerido que CDK1 podría estar siendo activado por ciclina A2 tras la sobreexpresión de MYC en ausencia de actividad CDK2. Por lo tanto, realizamos ensayos quinasa de complejos ciclina A2 procedentes de cdk2-/-MYC MEFs o de sus respectivos MEFs control y observamos un patrón de fosforilación de p27 similar al obtenido con CDK1. MYC inducía actividad quinasa asociada a ciclina A2 y el tratamiento de dichos complejos con Purvalanol A previo al ensayo quinasa reducía drásticamente dicha actividad (Fig. 4.3C). Para verificar la actividad quinasa de CDK1 sobre p27, decidimos ensayar un mutante inactivo de CDK1 en los cdk2-/- MEFs. Se trata de un mutante D146N (DN), que no presenta actividad quinasa. Utilizamos como control el vector vacío (EV) y un vector de sobreexpresión de CDK1 en su forma wild type (wt). Observamos que MYC era capaz de inducir actividad quinasa de CDK1 wt pero no así del mutante inactivo CDK1DN (Fig. 5A-D). A continuación decidimos estudiar qué fracción de la actividad CDK1 sobre p27 tras la sobreexpresión de MYC era debida a la activación por ciclina A2 de los complejos CDK1 y qué fracción era debida ciclina B1, ya que estaba descrito que complejos ciclina B1-CDK1 eran capaces de fosforilar la Thr187 de p27 in vitro (Montagnoli et al., 1999; Zhu et al., 2004). Para ello, silenciamos la expresión de ciclina A en cdk2-/-MYC MEFs y en cdk2-/- control MEFs (Fig. 4.5A), y realizamos ensayos quinasa de inmunocomplejos ciclina A2 y CDK1 procedentes de extractos proteicos de dichas células. Observamos que el silenciamiento de ciclina A2 redujo la actividad quinasa de dichos inmunocomplejos tanto en las células control como en los cdk2-/- MYC MEFs (Figs. 4.5B,C). Sin embargo observamos que la actividad quinasa de CDK1 no se veía afectada significativamente por el silenciamiento de ciclina A2 en ningún caso (Fig. 4.5D). Esto sugería que CDK1 podría estar interaccionando con otra ciclina, i. e. ciclina B1, formando un complejo capaz de fosforilar p27 en la Thr187. Por lo tanto, decidimos ensayar la actividad quinasa asociada a ciclina B1 en cdk2-/-MYC MEFs y tras el silenciamiento de ciclina A2. Observamos que MYC también era capaz de inducir la actividad quinasa asociada a complejos ciclina B1 en cdk2-/- MEFs, y que el silenciamiento de ciclina A2 no afectaba a dicha actividad (Figs. 4.6A,B). Hasta aquí, hemos descrito un nuevo mecanismo por el cual MYC induce fosforilación de p27 en la Thr187 a través de complejos ciclina A2/B1-CDK1, complementario al ya descrito (Bretones et al., 2011). En ausencia de CDK2, CDK1 compensaría su actividad, fosforilando p27 en la Thr187 y reduciendo sus niveles dentro de la célula, activando la vía de degradación de p27 dependiente del complejo SCFSKP2 vía proteasoma. Está descrito que, aunque los complejos ciclina E-CDK2, ciclina A2-CDK2 y ciclina B1-CDK1 son capaces de fosforilar p27 in vitro, sólo los complejos ciclina A2-CDK2 son capaces de interaccionar con el complejo SCFSKP2 ubiquitilando así p27(Montagnoli et al., 1999; Zhu et al., 2004). Por lo tanto, ciclina A2 parece ser indispensable en la interacción con el complejo SCFSKP2, de modo que proponemos un modelo en el que complejos ciclina A2-CDK1 fosforilan p27 en la Thr187 formando un complejo capaz de interaccionar con el SCFSKP2, ubiquitilando así p27 e inducido por MYC. A parte de inducir proliferación en ausencia de CDK2, MYC era capaz de inducir proliferación en ciclina E-/-MEFs. Por lo tanto, decidimos analizar la expresión de cdk1, cdk2, ccna2, ccnb1 y skp2 y observamos un incremento en la expresión de ccna2, ccnb1 y de skp2, mientras que los niveles de cdk1 y cdk2 permanecían relativamente constantes tras la sobreexpresión de MYC en estas células (Fig. 4.7). Aunque la interacción ciclina E-CDK1 había sido descrita en otros modelos(Aleem et al., 2005; Santamaria et al., 2007),no conseguimos reproducirlo en nuestro modelo de cdk2-/- MEFs. Por tanto, decidimos ensayar la actividad quinasa de CDK1 sobre p27 procedente de MEFs carentes de ciclina E. Observamos que, tanto CDK2 como CDK1 eran capaces de fosforilar p27 in vitro y que además el silenciamiento de ciclina A2 en estas células reducía la actividad quinasa de CDK2 en mayor medida que la reducción observada en la actividad de CDK1 (Fig. 4.8A). Esto sugiere que en ausencia de ciclina E y ciclina A2, CDK1 es capaz de formar complejos activos con otra ciclina, probablemente ciclina B1 (de acuerdo con lo anteriormente descrito), de forma contraria a lo que ocurre con CDK2. Además, la sobreexpresión de MYC en ciclina E-/- MEFs, incrementó la actividad quinasa de CDK1, mientras que la actividad quinasa asociada a ciclina A2 en estas células se mantuvo constante (Fig. 4.8B,C). Por lo tanto, podemos deducir de este modelo, que CDK1 es capaz de fosforilar p27 independientemente de ciclina E, y que MYC incrementa su actividad quinasa. Debido a la redundancia funcional descrita entre las diferentes CDKs y ciclinas (Satyanarayana and Kaldis, 2009), decidimos verificar nuestra hipótesis es un modelo celular carente de genes funcionales para CDK2, CDK4 y CDK6: TKO MEFs (Santamaria et al., 2007). Estas células sólo son capaces de crecer bajo condiciones de hipoxia, y presentan un ratio de proliferación muy lento. Infectamos estos TKO MEFs con lentivirus que contenían un vector de sobreexpresión de MYC y observamos que eran capaces de crecer bajo condiciones de normoxia. Por lo tanto, decidimos realizar gran parte de nuestros experimentos utilizando TKO MYC MEFs y reduciendo los niveles de MYC exógeno con shRNA, de forma que obteníamos un fenotipo similar al de los TKO MEFs capaces de ser cultivados en normoxia. Tras el silenciamiento de MYC en los TKO MYC MEFs, observamos una gran parada proliferativa de estas células (Fig. 4.9A,B), lo que sugiere que MYC es capaz de inducir proliferación en ausencia de CDK2, CDK4 y CDK6. Además, los niveles de expresión de ciclina A2, ciclina B1, CDK1 más altos en aquellos TKO MEFs que sobreexpresaban MYC, tanto a nivel de RNA como de proteína (Figs. 4.9D-F). Debido a que estas células expresan CDK1 como única CDK implicada en ciclo celular (cdk3 está mutado en esta línea de ratones (Ye et al., 2001), ensayamos un anticuerpo capaz de reconocer las secuencias consenso fosforiladas por las CDKs en extractos totales de TKO vs TKO MYC MEFs y TKO MYC MEFs vs shMYC TKO MYC MEFs, y observamos un incremento de actividad quinasa en aquellas células que sobreexpresaban MYC, la cual se debería principalmente a CDK1 (Figs. 4.10A,B). Por lo tanto, podemos concluir que MYC es capaz de inducir actividad quinasa de CDK1 en TKO MEFs. A continuación, decidimos analizar los niveles de SKP2 y p27 en este modelo, y observamos que MYC inducía la expresión de SKP2 y se correlacionaba con bajos niveles de p27 (Fig. 4.11A,B).Este resultado indicaba que MYC parecía estar induciendo la degradación de p27 a través del complejo SCFSKP2 en TKO MEFs. Decidimos estudiar la fosforilación de p27 en la Thr187 en extractos totales de TKO MYC MEFs. En primer lugar estimulamos las células con suero y observamos un incremento en los niveles de fosforilación de p27, junto con un incremento en los niveles de expresión de MYC, SKP2 y CDK1 (Fig. 4.12A). Además, el tratamiento de estas células con Roscovitina (un inhibidor de la actividad quinasa de CDK1/CDK2) redujo drásticamente los niveles de fosforilación de p27 (Fig. 4.12B). De esta forma demostramos que los TKO MYC MEFs son capaces de inducir la fosforilación de p27 en la Thr187, probablemente a través de la activación de CDK1. Para demostrar la actividad de CDK1 sobre p27, realizamos ensayos quinasa in vitro. Ensayamos la actividad de complejos CDK1 procedentes de TKO MEFs vs TKO MYC MEFs, y observamos que la expresión ectópica de MYC inducía fosforilación de p27 a través de complejos CDK1 y que el tratamiento con Purvalanol A inactivaba eficazmente dichos complejos (Fig. 4.13A-C). Finalmente, decidimos estudiar qué ciclina era la encargada de activar CDK1 en estas células. Para ello immunoprecipitamos ciclina A2, ciclina B1, ciclina E y CDK1 y observamos que, tanto los complejos ciclina A2 como los ciclina B1 unían CDK1 y fosforilaban p27 in vitro (Fig. 4.14A). Sin embargo, no observamos interacción de CDK1 con ciclina E y tampoco fosforilaciónin vitro de p27 en los inmunoprecipitados de ciclina E2 (Fig. 4.14A), a pesar de estar descrita su interacción en estas células (Santamaria et al., 2007). Los inmunocomplejos CDK1 mostraron actividad quinasa sobre p27, aunque parecían ser mucho menos eficientes que los complejos ciclina A2 y ciclina B1 (Fig. 4.14A). Esto podría deberse a que la mayor parte de la CDK1 que conseguimos inmunoprecipitar se encuentre en forma libre, sin interaccionar con ninguna ciclina, de modo que sería inactiva. Para verificar dicha hipótesis realizamos un fraccionamiento de extractos proteicos procedentes de cdk2-/-control MEFs y cdk2-/- MYC MEFs mediante cromatografía de gel-filtración. De esta forma observamos que un porcentaje muy elevado de la CDK1 presente en las células se correspondía con su “forma libre” o estado inactivo, mientras que sólo una pequeña cantidad de CDK1 se encontraba asociada a ciclinas (Fig. 4.14B). Realizamos ensayos quinasa inmunoprecipitando complejos CDK1 de las fracciones que contenían la CDK1 asociada a ciclinas y la CDK1 en su forma libre. Observamos que la CDK1 en forma libre era inactiva, y que la obtenida de las fracciones en las que se encontraba asociada a ciclinas mostraba actividad quinasa sobre p27 (Fig. 4.14C). De esta forma explicamos la diferencia de actividad observada al comparar los complejos ciclina A2/B1 con los complejos CDK1. Como confirmación definitiva, decidimos comprobar el efecto de MYC en la actividad quinasa de CDK1 sobre p27 utilizando un modelo de CDK1 knock out condicional de ratón. Sobreexpresamos MYC en células cdk1lox/lox tratadas con 4HT para eliminar el gen y la expresión de CDK1, y realizamos ensayos quinasa inmunoprecipitando ciclina B1 y ciclina A2. Hay que tener en cuenta que en este modelo está presente CDK2, que interacciona con ciclina A2 y presenta actividad quinasa sobre p27. Observamos que en los controles la sobreexpresión de MYC incrementaba la actividad quinasa asociada tanto a complejos ciclina B1 como a complejos ciclina A2. Sin embargo, la eliminación de CDK1 inhibía totalmente la actividad quinasa asociada a ciclina B1 y MYC no era capaz de revertir dicho efecto. Por tanto los complejos CDK1-ciclina B1 eran capaces de fosforilar p27 y MYC induce esta actividad. Por el contrario, la eliminación de CDK1 conllevó un incremento de la actividad quinasa de los complejos ciclina A2, y la sobreexpresión de MYC supuso un incremento aún mayor (Fig. 4.15A-E). Esto parece indicar que CDK2 no es capaz de formar complejos activos con ciclina B1, y que toda su actividad procede de la actividad quinasa de CDK1. Por otro lado, en ausencia de CDK1, ciclina A2 estaría totalmente unida a CDK2, la cual parece ser más eficiente fosforilando p27 comparado con los complejos ciclina A2-CDK1 debido al incremento de actividad de ciclina A2 en ausencia de CDK1. En la primera parte de esta Tesis Doctoral, hemos descrito un mecanismo complementario al ya descrito a través del cual MYC es capaz de inducir la degradación de p27. A parte de CDK2, CDK1 es capaz de interaccionar con ciclina A2 y ciclina B1 formando complejos activos inducidos por MYC que presentan actividad quinasa sobre p27, fosforilándolo en la Thr187, la cual es necesaria para su degradación vía proteasoma a través del complejo SCFSKP2. Además, hemos descrito que tanto en ausencia de CDK2, como en ausencia de CDK4 y CDK6, MYC es capaz de inducir proliferación a través de la activación de complejos ciclina-CDK. Hemos demostrado que MYC induce la fosforilación de p27 en la Thr187 a través de CDK1 y la activación del complejo SCFSKP2 debido a la inducción de la expresión de SKP2 por MYC. 3.2. El papel de MYC en la diferenciación eritroide. El estudio de la diferenciación eritroide ha sido una de las principales líneas de investigación de nuestro laboratorio. Resultados previos en nuestro laboratorio a lo largo de los años han demostrado que el tratamiento de las células K562 (una línea celular derivada de una leucemia mieloide crónica, con capacidad para diferenciar hacia el linaje mieloide) con diferentes drogas (Ara-c, Imatinib, TPA) inducía diferenciación, la cual era contrarrestada por la expresión ectópica de MYC. En todos los casos, ese proceso de diferenciación iba acompañado de una bajada en los niveles endógenos de MYC, así como de una parada proliferativa. De hecho, en los casos en los que los tratamientos con ciertas drogas (i. e. INF-alfa) provocaba parada proliferativa sin una disminución en los niveles de expresión de MYC, las células no sufrían dicho proceso de diferenciación. Esto sugería que MYC era capaz de regular los procesos de diferenciación de forma independiente al estado proliferativo de la célula. Utilizando el modelo celular Kp27MER (línea celular derivada de las K562 que contiene un gen de p27 inducible por Zn2+ y la proteína quimérica MYC-ER, activable por tamoxifeno) se observó que la sobreexpresión de p27 inducía parada proliferativa y diferenciación eritroide. También se demostró que la activación de la proteína quimérica MYC-ER era capaz de inhibir el proceso de diferenciación sin rescatar la parada proliferativa inducida por la sobreexpresión de p27. Por todo esto, nos planteamos estudiar el efecto directo de la bajada de los niveles de MYC en la diferenciación eritroide. En primer lugar, silenciamos la expresión de MYC en la línea celular K562 con partículas lentivirales que contenían shRNA específico para este gen, y observamos parada proliferativa asociada a un incremento en la diferenciación eritroide, medida por el incremento en los niveles de hemoglobina en las células (test de bencidina) (Fig. 4.17A-D) y por la inducción de la expresión de marcadores y factores de transcripción eritroides (Fig. 4.18A). Además, estudiamos la variación de la expresión del resto de genes de la familia MXD, ya que son considerados antagonistas de MYC compitiendo con él por su unión por MAX y las cajas E y además algunos de ellos se han visto implicados en procesos de diferenciación. Observamos un incremento en los niveles de ARN mensajero de MXD1, MXD3 y MXD4, mientras que MNT y MXI1 se mantienen relativamente constantes (Fig. 4.18B). Por otro lado, tratamos de ver el efecto sobre la diferenciación eritroide en K562 utilizando el inhibidor de MYC 10058-F4, un compuesto que impide la dimerización MYC/MAX. Observamos parada proliferativa y un descenso tanto de la actividad como de los niveles de MYC en la célula (Fig. 4.19A-C). Además, comprobamos que la inhibición de la dimerización fuera específica de MYC/MAX y que no afectara a la interacción MXD/MAX mediante co-inmunoprecipitación. Observamos que los niveles de MNT que co-inmunoprecipitaban con MAX eran similares en células tratadas con el compuesto frente a las células control (Fig. 4.19D). Sin embargo, no observamos inducción de la diferenciación eritroide tras el tratamiento con esta droga en K562, si no muerte por apoptosis sin observar un incremento en los marcadores de diferenciación a los tiempos y concentraciones utilizados (Fig. 4.19F). Durante determinados procesos de diferenciación celular se ha observado un cambio de actividad de complejos MYC/MAX hacia complejos MXD/MAX (Ayer and Eisenman, 1993). Además, se ha descrito que MXD1 induce diferenciación eritroide, y que MYC es capaz de contrarrestar dicho efecto (Acosta et al., 2008; Cultraro et al., 1997). Para comprobar la importancia del papel de MXD1 durante la diferenciación eritroide y determinar si la inducción de la diferenciación por una bajada en la actividad de MYC era debida a un incremento en la actividad de los complejos MXD1/MAX, decidimos silenciar la expresión de MXD1 en K562 e inducir el proceso de diferenciación eritroide tratando las células con Imatinib. Tras 24 horas de tratamiento observamos que, tanto las células control como las que tenían MXD1 silenciado, presentaban una bajada en los niveles de MYC, tanto a nivel de RNA como de proteína (Fig. 4.20A,B). Además, el silenciamiento de MXD1 no afectaba al proceso de diferenciación eritroide, ya que tanto las células control como las silenciadas mostraban inducción de diferenciación eritroide ya que presentaban un incremento en los niveles de hemoglobina, analizado tanto por western blot como por el test de bencidina (Fig. 4.20B,C). De esta forma demostramos que MXD1 no es esencial durante este proceso. Sin embargo, otros miembros de la familia MXD han sido relacionados con procesos de diferenciación (Queva et al., 1998). Para comprobar si el resto de miembros de la familia MXD eran necesarios durante el proceso de diferenciación eritroide inducido por la bajada de la actividad de MYC, decidimos silenciar la expresión de MAX. Si eliminamos MAX del entorno celular, inhibiremos tanto la actividad de los complejos MYC/MAX como de los MXD/MAX. Por lo tanto planteamos dos hipótesis: 1) que el proceso de diferenciación eritroide inducido por la bajada de la actividad de MYC sea independiente de la actividad MXD/MAX el silenciamiento de MAX induciría diferenciación eritroide; 2) que el proceso de diferenciación eritroide inducido por la bajada de la actividad de MYC dependa de un incremento en la actividad de los complejos MXD/MAX el silenciamiento de MAX no inducirá diferenciación eritroide. Silenciamos la expresión de MAX infectando K562 con partículas lentivirales que contenían shRNA específico para dicho gen, y observamos una parada proliferativa, acompañada de una bajada de los niveles de MYC a nivel de proteína (pero no a nivel de ARN mensajero) y de una disminución de su actividad, medida por la bajada de expresión de LDHA. Además, dicha bajada de la actividad de MYC iba acompañada de un incremento de hemoglobina en las células (Fig. 4.22B) similar al observado al silenciar la expresión de MYC. Dicha inducción de la diferenciación eritroide por el silenciamiento de MAX se verificó por el test de bencidinas y el análisis de la expresión de marcadores eritroides (Figs. 4.21A,B). Decidimos analizar la expresión de los genes MXD tras el silenciamiento de MAX, y observamos un incremento en los niveles de expresión tanto de MXD1, MXD3 y MXD4 (mismo efecto que el observado tras el silenciamiento de MYC), así como de MNT, mientras que los niveles de MXI1 se mantenían constantes (Fig. 4.22D). Estos cambios de expresión no tendrían efecto sobre la actividad de los complejos MXD/MAX, debido a que hemos eliminado la presencia de MAX en la célula. Así podemos descartar que el efecto de la diferenciación por la bajada de MYC sea un incremento en la actividad MXD/MAX, y por tanto, esto sugiere que MYC tiene una función directa sobre el proceso de diferenciación eritroide en K562. La mayoría de los procesos de diferenciación conllevan una parada proliferativa. De hecho, en todos los modelos utilizados hasta ahora en este trabajo, la diferenciación eritroide va acompañada de una bajada de la actividad de MYC y parada proliferativa. Por lo tanto no se puede descartar que el proceso de diferenciación sea consecuencia del arresto proliferativo debido a la bajada de los niveles de MYC en las células. Para tratar de abordar esta cuestión, tratamos de establecer una línea estable de K562 que contuviera un shRNA inducible específico para MYC, de modo que pudiéramos ver una bajada de MYC y una posible inducción de genes de diferenciación previo a la parada proliferativa. Sin embargo, tras varios intentos, no hemos conseguido establecer dicha línea celular. Por lo tanto, indujimos diferenciación eritroide en K562 mediante el tratamiento con Imatinib y medimos la expresión de genes eritroides y MYC a tiempos cortos, pudiendo comprobar en paralelo el estado proliferativo de las células. Observamos que a 12 horas de tratamiento la expresión de MYC había disminuido y los marcadores de diferenciación comenzaban a expresarse, mientras que la expresión de ciclina A2 se mantenía constante (Fig. 4.24). Esto parece indicar que MYC regula directamente genes necesarios para el proceso de diferenciación eritroide, de forma independiente a su función en proliferación celular. Sin embargo, se necesitan más experimentos que verifiquen esta aproximación. A lo largo de la segunda parte de esta tesis doctoral hemos intentado profundizar en la importancia de MYC en la diferenciación eritroide. Hemos demostrado que la bajada de la actividad de MYC induce diferenciación eritroide en células K562, y que este efecto es independiente de la actividad de los complejos MXD/MAX, aunque no podemos descartar que alguna de las proteínas de la familia MXD ejerza una función independiente de MAX, por ejemplo, a través de MLX. Además, los resultados obtenidos con el tratamiento a tiempos cortos de Imatinib parecen indicar que MYC regula este proceso de forma directa, y que no es una consecuencia de la parada proliferativa debida a la disminución de su actividad. Entender el mecanismo por el cual MYC regula los procesos de diferenciación es de gran importancia debido a la relación que guarda con los procesos tumorogénicos dependientes de MYC ya que se ha visto que la inactivación de MYC en diferentes modelos de ratón ha llevado a una regresión tumoral acompañada de un proceso de re-diferenciación de las células tumorales (Leon et al., 2009).