Generación de nuevos modelos celulares neuronales de ataxia de Friedreichcaracterización de la neurodegeneración por deficiencia de Frataxina

Resumen

I. ABREVIATURAS 23 II. SUMMARY 29 III. INTRODUCCIÓN 33 1. La ataxia de Friedreich 33 1. 1. Patología y manifestaciones clínicas 33 1. 2. Bases moleculares de la ataxia de Friedreich 34 1. 3. Estructura y función de la frataxina 36 1. 4. Modelos experimentales de ataxia de Friedreich 39 1. 4. 1. Modelos celulares 39 1. 4. 2. Modelos animales 40 1. 4. 2. 1. Ratones transgénicos Knock-Out 41 1. 4. 2. 2. Otros modelos de ratón transgénico 42 1. 5. Perspectivas terapéuticas para la ataxia de Friedreich 42 2. La tecnología de interferencia de RNA 44 3. Utilización de los progenitores neurales como sistema modelo experimental 47 4. Muerte Celular: características y tipos 49 4. 1. La alteración en la mitocondria es un paso previo en los procesos de muerte 50 4. 2. Mecanismos moleculares implicados en la ejecución de la apoptosis 54 4. 3. Muerte independiente de caspasas: AIF, lisosomas y calpaínas 57 4. 4. Necroptosis 59 4. 5. Muerte celular con autofagia 59 4. 5. 1. Bases moleculares de la inducción de autofagia 61 4. 5. 2. Generación de los autofagosomas 62 5. Dinámica mitocondrial y Mitofagia 63 IV. OBJETIVOS 69 V. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Materiales y reactivos 73 2. Mantenimiento de la colonia de ratones transgénicos 74 3. Cultivos celulares 77 3. 1. Cultivos de líneas celulares 77 3. 2. Diferenciación de las líneas de neuroblastoma humano 78 3. 3. Cultivos primarios 79 3. 3. 1. Neuronas de corteza cerebral de ratón 79 3. 3. 2. Neuronas granulares de cerebelo de ratón 80 3. 3. 3. Astrocitos de corteza cerebral de ratón 80 3. 3. 4. Progenitores neuronales de corteza cerebral 81 3. 4. Tratamientos de los cultivos celulares 82 4. Generación de vectores virales 82 4. 1. Empaquetamiento y titulación de vectores derivados de Lentivirus 82 4. 2. Empaquetamiento y titulación de vectores derivados de Retrovirus 86 Índice 18 4. 3. Empaquetamiento y titulación de vectores derivados de HSV-1 mediante el sistema dependiente de virus auxiliar 87 5. Análisis de proteínas mediante electrotransferencia e inmunodetección (western-blot) 88 6. Inmunocitoquímica 91 6. 1. Tratamiento y Tinción con Bromo-deoxiuridina 91 6. 2. Detección de la fragmentación del DNA nuclear: tinción de TUNEL 92 7. Determinación de la viabilidad celular 92 8. Tinción de Anexina V 93 9. Medida de estrés oxidativo 94 10. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo 94 11. Determinación del contenido celular en vesículas acídicas mediante la tinción con naranja de acridina 95 12. Análisis estadístico 96 VI. RESULTADOS 1. Generación de nuevos modelos celulares de ataxia de Friedreich utilizando los ratones transgénicos condicionales para la frataxina 99 1. 1. Cultivos primarios de neuronas de corteza cerebral de ratón 99 1. 1. 1. Caracterización fenotípica de la población neuronal del cultivo primario de corteza neuronal 99 1. 1. 2. Caracterización de la deficiencia de frataxina 103 1. 2. Cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo de ratón 107 1. 2. 1. Caracterización del fenotipo 107 1. 2. 2. Transducción con los vectores lentivirales portadores de la recombinasa Cre 108 1. 3. Cultivos primarios de astrocitos de corteza cerebral de ratón 112 1. 3. 1. Eficiencia de transducción de los cultivos 113 1. 3. 2. Eliminación de la frataxina: experimentos de dosis y tiempo 114 1. 3. 3. Sensibilidad a estrés: viabilidad celular de astrocitos deficientes en frataxina 117 1. 4. Aislamiento y caracterización de progenitores neurales de ratones modificados genéticamente 119 1. 4. 1. Obtención de progenitores neurales a partir de corteza cerebral embrionaria de los ratones modificados genéticamente para frataxina 119 1. 4. 2. Transducción e inmortalización de los progenitores mediante el uso de vectores virales 120 1. 4. 3. Obtención de líneas clonales de progenitores neurales 123 1. 4. 4. Potencial neurogenerador de los progenitores: diferenciación de las líneas celulares 125 2. Obtención de un nuevo modelo celular de deficiencia de frataxina utilizando células humanas SH-SY5Y 126 2. 1. Morfología y eficiencia de transducción con vectores virales 127 2. 2. Caracterización de la deficiencia de frataxina en células SH-SY5Y en proliferación 130 Índice 19 2. 2. 1. El silenciamiento de la frataxina en células SH-SY5Y en proliferación genera muerte y parada de ciclo celular 131 2. 2. 2. Las células SH-SY5Y que carecen de frataxina presentan defectos de adhesión al sustrato 135 2. 2. 3. El estrés oxidativo aumenta en las células que carecen de frataxina 137 2. 2. 4. El silenciamiento de la frataxina no afecta sustancialmente al proceso de diferenciación 138 2. 3. Caracterización de la deficiencia de frataxina en células humanas similares a neuronas: SH-SY5Y diferenciadas 141 2. 3. 1. Incremento en la muerte neuronal en respuesta a la eliminación de la frataxina 143 2. 3. 2. Caracterización de la muerte en respuesta al silenciamiento de frataxina: apoptosis 145 2. 3. 3. Implicación de la calpaína en la muerte celular por silenciamiento de frataxina 148 2. 3. 4. Análisis de la fragmentación del DNA nuclear como consecuencia de la eliminación de la frataxina 150 2. 3. 5. Implicación en la muerte por silenciamiento de frataxina de la proteína supresora de tumores p53 153 2. 3. 6. Translocación de fosfatidilserina 155 2. 3. 7. La deficiencia de frataxina no induce la translocación de AIF desde la mitocondria hasta el núcleo 156 2. 3. 8. Defectos de adhesión en las células deficientes 157 2. 3. 9. Alteraciones en la morfología mitocondrial en las células carentes de frataxina 159 3. Recuperación parcial del fenotipo salvaje mediante el empleo de lentivectores codificantes para la frataxina: prueba de principio para una estrategia de terapia génica 160 3. 1. La expresión de la frataxina reduce el porcentaje de células con núcleos apoptóticos 161 3. 2. El rescate con la frataxina endógena reduce, si bien no bloquea, la activación de caspasa-3 163 4. Implicación de la autofagia en la neurodegeneración causada por el déficit de frataxina 164 4. 1. El tratamiento con inductores de autofagia no protege frente a la muerte por deficiencia de frataxina 164 4. 1. 1. Experimentos en células en proliferación 165 4. 1. 2. Experimentos en células SH-SY5Y diferenciadas: efecto de la autofagia sobre neuronas maduras 170 5. Efecto neuroprotector de ß-catenina sobre las células deficientes en frataxina 174 VII. DISCUSIÓN 1. Generación de nuevos modelos neuronales de deficiencia de frataxina 179 1. 1. Necesidad de establecer nuevos modelos celulares neuronales 179 1. 2. Cultivos primarios de neuronas y astrocitos obtenidos de ratones modificados genéticamente 180 1. 3. Cultivo de células progenitoras neuronales de ratones modificados genéticamente 182 1. 4. Interferencia con la expresión de frataxina en células humanas similares Índice 20 a neuronas 183 2. Caracterización de los procesos de muerte celular en respuesta a la deficiencia de frataxina 184 2. 1. Muerte celular apoptótica 184 2. 2. Eventos tempranos disparados por el déficit de frataxina 185 2. 2. 1. Implicación del estrés oxidativo 185 2. 2. 2. Alteración del citoesqueleto celular 186 2. 2. 3. Cambio de la distribución de las mitocondrias 186 2. 3. Posible papel de la autofagia en la neurodegeneración inducida por el déficit de frataxina 188 2. 4. Búsqueda de agentes neuroprotectores 191 2. 5. Terapia génica 192 3. Perspectivas de futuro 193 VIII. CONCLUSIONES 197 IX. BIBLIOGRAFÍA 203 X. ANEXO: PUBLICACIONES 235