Bax?5 at lipid membranesStructure, assembly and pore formation

Resumen

La proteína proapoptótica Bax facilita la la liberación de factores apoptóticos, tales como el citocromo c, desde la mitocondria hacia el citosol. Se piensa que dicha función se basa en la capacidad formadora de poros de Bax. La estructura de formas hidrosolubles de Bax consiste en una horquilla central rodeada por varias hélices anfipáticas. La horquilla constituye el dominio formador de poros. No obstante, la estructura de Bax en la membrana así como la estructura de los poros incudidos por Bax no es bien conocida. Con el objetivo de profundizar en estos aspectos optamos por una estrategia reduccionista consistente en el estudio de la estructura y actividad formadora de poros de un péptido derivado de la horquilla central, Bax¿5. Dicho péptido se obtuvo mediante síntesis peptídica en fase solida y se purificó mediante cromatografía en fase reversa. Como membranas modelo se usaron principalmente vesículas unilamelares grandes. En primer lugar se estudió la interacción de Bax¿5 con membranas mediante espectroscopía de dicroísmo circular obteniéndose un contenido de hélice-¿ en torno al 60%. En segundo lugar se estudió la capacidad de Bax¿5 para interaccionar consigo mismo y con polipéptidos derivados de la proteína antiapoptótica Bcl-xL usando principalmente la técnica de transferencia de energía por resonancia. Se concluyó que Bax¿ es capaz de formar dímeros paralelos en membranas. El residuo de tirosina (en la posición 115 de Bax) es el principal responsable de la dimeración de Bax¿5. Asímismo se demostró que Bax¿5 puede interaccionar con Bcl-xL¿5 si bien dicha asociación no alteraa la formación de poros por parte de Bax¿5. La estructura y orientación de Bax¿5 en membranas se estudió mediante la dicroísmo infrarrojo específico de sitio. Usando la estrategia de modelo de cuerpo rígido el mejor ajuste a los datos experimentales se obtuvo para un dímero asimétrico con ángulos de inclinación de 74º y 60º para cada subunidad, lo que sugiere una localización interfacial del péptido en la membrana. Finalmente es estudió la actividad formadora de poros de Bax¿5. Experimentos de liberación de contenidos en poblaciones de vesículas lipídicas sugieran que los residuos de lisina son los principales responsables de la actividad permeabilizadora de Bax¿5. Análisis con vesículas individuales demuestran que los poros formados por Bax¿5 reducen su tamaño con el tiempo pero nunca llegan a cerrarse del todo. La apertura de dichos poros depende tanto de la concentración de Bax¿5 en la membrana como de factores estocásticos.