Nanomecánica de la ß-catenina e interacciones proteína-proteína

Resumen

Las fuerzas mecánicas juegan un papel fundamental en los sistemas biológicos. Las proteínas y las interacciones intermoleculares entre proteínas sufren estrés mecánico en procesos celulares tan cotidianos como el transporte a través de membrana, los procesos de adhesión celular, la segregación cromosómica o la replicación del ADN. La fuerza es una magnitud vectorial, por lo que la dirección de su aplicación es difícil, si no imposible de controlar mediante experimentos de bioquímica clásica. A nivel de moléculas individuales, la magnitud de estas fuerzas es tan pequeña que ha sido necesario el desarrollo de sofisticadas técnicas experimentales para medirlas y controlarlas. Entre ellas destaca la espectroscopia de fuerzas de molécula individual basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-SMFS), que ha permitido un avance sin precedentes en el análisis molecular de las propiedades mecánicas de proteínas y en el estudio directo de las fuerzas que mantienen las interacciones proteína-proteína. En los metazoos, el sistema cadherina/catenina constituye una pieza clave en la maquinaria de adhesión célula-célula, que no sólo media los contactos directos entre células vecinas, sino que constituye un elemento esencial del proceso de mecanotransducción que se lleva a cabo en estas zonas de contacto. Las cadherinas en la superficie de las células interaccionan con las cadherinas de las células vecinas, y simultáneamente mantienen una conexión mecano-funcional con el citoesqueleto contráctil de actomiosina mediante un complejo de proteínas citosólicas. Entre ellas se encuentra la ?-catenina, esencial para la mediación de la continuidad mecánica que existe entre el dominio extracelular de las cadherinas y el esqueleto de actomiosina, y en el proceso de mecanotransducción que llevan a cabo estas estructuras. Así pues, conocer las propiedades mecánicas de esta proteína parece clave para poder empezar a entender el funcionamiento interno del sistema cadherina/catenina. Por todo ello, en este trabajo se ha llevado a cabo el estudio de las propiedades nanomecánicas de la ?-catenina mediante AFM-SMFS. Nuestros resultados muestran que la región ARM (armadillo) de la ?-catenina presenta una baja estabilidad mecánica y sugieren que sus propiedades mecánicas son muy sensibles a pequeños cambios en la estructura. El desplegamiento mecánico de esta estructura puede ocurrir a través de múltiples caminos, con diferentes intermedios, lo que indica que el proceso tiene lugar a través de un paisaje energético rugoso con mínimos energéticos muy superficiales. Este desplegamiento mecánico puede ser modulado por sus terminales desestructurados. Considerando que la fuerza media de desplegamiento de la ?-catenina está en el rango de fuerzas que soportan las adhesiones cadherina-cadherina y que algunas de las repeticiones de la región ARM pueden desplegarse a baja fuerza (por debajo de la resolución del aparato de medida), la ?-catenina podría actuar como un tampón mecánico a lo largo de todo el rango de fuerzas al que podría estar sometida, "sacrificando" algunas de sus repeticiones para mantener los contactos entre las uniones cadherinas y el citoesqueleto de actina. Debido a su sensibilidad en torno a los pocos picoNewtons y su precisión subnanométrica, el AFM se ha convertido en una herramienta esencial no sólo en la medida de las propiedades mecánicas de proteínas y en la energética y dinámica de sus interacciones intramoleculares, sino que también se ha impuesto como una poderosa herramienta en la exploración de las fuerzas y la dinámica de las interacciones entre proteínas. La estrategia general en estos estudios reside en unir una de las proteínas a la punta del AFM y la otra a la superficie de un sustrato, midiendo la fuerza de desunión provocada al alejar la superficie de la punta tras establecer contacto. Sin embargo, esta estrategia hace imposible distinguir el evento de ruptura de la interacción de los eventos de despegado de las proteínas de cualquiera de las superficies, o de interacciones inespecíficas punta-superficie. En el trabajo que aquí se presenta proponemos una estrategia autocontrolada para la medida de interacciones intermoleculares, que permita la identificación directa del pico de fuerza provocado por la ruptura de una interacción proteína-proteína. El diseño está basado en una estrategia general y modular, que no depende de las características o la naturaleza de las proteínas estudiadas, y que descansa en la incorporación de dos tipos de marcadores: marcadores de monomolecularidad a las proteínas de interés (basados en poliproteínas); y un marcador específico de la interacción (la exposición a la fuerza de un polipéptido elastomérico que une de forma covalente las dos proteínas interaccionantes). Como demostración a nivel de prueba de concepto de que este diseño es posible, se ha implementado con éxito esta estrategia en una interacción modelo, la interacción del par cohesina/dockerina de Clostridium thermocellum.