Towards the standardization of nanoecotoxicity testingSelection of environmentally relevant methods

Resumen

El presente estudio abarca un estado del arte sobre la evaluación de riesgos de nanomateriales fabricados (MNMs) y tres publicaciones sobre la materia. A continuación se presenta un compendio de la investigación y los avances realizados.El objetivo del presente trabajo, establecido en el Capítulo 1, fue definir métodos de ensayo para superar las limitaciones actuales en la evaluación toxicológica de los MNMs en ecosistemas acuáticos. Éstos últimos constituyen una de las vías más importantes para la entrada y transferencia de nanomateriales en las cadenas alimentarias, pero la falta de protocolos estandarizados para evaluar su seguridad ha dado lugar a incertidumbres y resultados contradictorios sobre sus características de exposición y ecotoxicidad.Varias organizaciones expertas coinciden en que los métodos de evaluación de riesgos para productos químicos tradicionales son en gran medida aplicables a los MNMs. Sin embargo, determinados aspectos, tales como la preparación y caracterización de muestras, la dosimetría, o la exposición y organismos modelo, requieren el desarrollo de protocolos estandarizados y validados. El presente estudio ha realizado dos aportaciones fundamentales a esta cuestión: la optimización de la energía proporcionada a los MNMs durante la preparación de las dispersiones acuosas y la selección de una materia orgánica natural de referencia para llevar a cabo la exposición en condiciones similares a las del medioambiente.La Publicación 1 ha establecido el punto de partida para los estudios posteriores, orientándose hacia la definición de métodos de dispersión de nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs) y la determinación de concentraciones en los medios acuosos de los organismos, que constituyen aspectos relevantes para obtener resultados de ecotoxicidad precisos. Los MWCNTs se producen a nivel mundial a gran escala y su número de aplicaciones crece constantemente. La espectroscopía UV-visible (UV/Vis) ha sido una de las técnicas más utilizadas en los últimos diez años para determinar cuantitativamente sus concentraciones en las dispersiones. Un factor clave en este cometido es la preparación de curvas de calibración basadas en dispersiones de concentraciones ya conocidas. Algunos estudios previos no han utilizado exactamente los mismos métodos (diferentes procesos de ultrasonicación) para preparar las muestras para las curvas de calibración y para los análisis de toxicidad, lo cual podría originar resultados erróneos en los valores de concentraciones.Este trabajo ha analizado si distintas técnicas de preparación producen el mismo estado de dispersión de los MWCNTs e idénticos resultados de absorbancias UV/Vis. Las dispersiones de calibración se prepararon mediante una sonda de ultrasonidos y la `verificación¿ se llevó a cabo con dispersiones preparadas en un baño de ultrasonidos. Además, se calculó y optimizó la energía acústica proporcionada por los equipos de ultrasonidos a los nanotubos durante la preparación de las dispersiones. Este aspecto no se había considerado en algunos trabajos publicados, dando lugar a daños significativos en los MWCNTs y alterando su comportamiento en el contexto de los ensayos de toxicidad. Por otra parte, teniendo en cuenta que la bibliografía también muestra variaciones en las longitudes de onda utilizadas para efectuar las medidas de absorbancia, se propuso un procedimiento (Figura 1) para determinar la longitud de onda adecuada para cada tipo de nanotubo estudiado. Tras la optimización de los parámetros de las dispersiones se llevaron a cabo los ensayos de ecotoxicidad de los MWCNTs en Vibrio fischeri. Este organismo se seleccionó teniendo en cuenta que estas bacterias representan a los organismos acuáticos más simples, y la entrada a la cadena alimentaria en muchos ecosistemas.Los resultados obtenidos han demostrado que la absorbancia UV/Vis depende completamente del método de dispersión. Las dispersiones de las curvas de calibración y las dispersiones para los ensayos de toxicidad deberían prepararse mediante el mismo método para obtener los mismos resultados de absorbancia. Figura 1 Espectro ultravioleta-visible de las dispersiones de MWCNTs considerando el ácido húmico (línea de puntos) y el agua ultrapura (línea de trazos) como solución blanco para los nanotubos CNT-N (A) y CNT-A (B), y las longitudes de onda de medida seleccionadas para preparar las curvas de calibración y llevar a cabo las verificaciones. CNT-N = Nanocyl NC7000; CNT-A = Arkema Graphistrength C100; HA = ácido húmico.La técnica de Dispersión Dinámica de Luz (DLS) se ha utilizado para determinar los tamaños de aglomerado de los MWCNTs y ha permitido observar que la sonda de ultrasonidos es el método de dispersión que produce las tasas de aglomeración más bajas y una mejor optimización de la energía (Figura 2). Por lo tanto, la sonda ha sido la técnica seleccionada para preparar las dispersiones de los ensayos de ecotoxicidad. Finalmente, las mejoras en el rendimiento de las dispersiones también han contribuido al incremento de la fiabilidad de los resultados de ensayo y de los datos disponibles sobre efectos adversos de MWCNTs en V. fischeri.N en las dispersiones de calibración y verificación.Una vez que los métodos de dispersión fueron optimizados, la investigación realizada en la Publicación 2 planteó como objetivo la comparación de las cinéticas de aglomeración y la ecotoxicidad de los MWCNTs en presencia de ambientes acuáticos de diferentes composiciones químicas, con el fin de determinar las más apropiadas para satisfacer la necesidad actual de regulación.Aparte de los métodos de dispersión y las técnicas para determinar las concentraciones (analizadas en la Publicación 1), otros factores tales como las impurezas, las modificaciones superficiales, estructuras variables y rutas de exposición de los nanotubos, han dado lugar a los resultados divergentes de toxicidad que se han publicado hasta ahora. Además, su hidrofobicidad inherente suele originar aglomeración y sedimentación, que dificultan la estabilidad necesaria para efectuar la evaluación ecotoxicológica en medios acuosos. La composición química de los sistemas acuáticos también determina su biodisponibilidad. Estudios previos han analizado las interacciones entre los MWCNTs y las sustancias presentes en aguas naturales, tales como sales que contienen iones monovalentes y divalentes, y materia orgánica natural (NOM). Fuerzas iónicas altas y pHs bajos inducen la desestabilización de los nanotubos, mientras que las sustancias húmicas (el componente predominante en la NOM) fomentan su estabilización. La materia orgánica natural del río Suwannee (SR-NOM) y el ácido húmico de Sigma-Aldrich han sido las sustancias orgánicas más ampliamente referenciadas en esta materia. La primera presenta la ventaja clave de simular los ecosistemas reales en los ensayos de toxicidad, a diferencia de las sustancias húmicas sintetizadas en laboratorio. Muchos autores han demostrado la influencia del tipo de materia orgánica utilizado en los ensayos en los efectos adversos de los MWCNTs en organismos acuáticos.La investigación llevada a cabo ha comparado las cinéticas de aglomeración y la ecotoxicidad de los MWCNTs en presencia de las materias orgánicas natural y artificial más utilizadas en estudios previos; SR-NOM y ácido húmico de Sigma-Aldrich, respectivamente (Figura 3). Se han estudiado los efectos inhibidores en Daphnia magna, que son organismos invertebrados clave en los ensayos normalizados de ecotoxicidad.La caracterización realizada mediante DLS, espectroscopía UV/Vis y microscopía electrónica de barrido (SEM) ha indicado que la NOM proporciona una mayor estabilidad a las dispersiones de MWCNTs con respecto a la materia orgánica sintética. El ácido húmico de Sigma-Aldrich pareció alterar la respuesta de los organismos a los nanotubos, en comparación con la observada en presencia de SR-NOM (Tabla 1 y Figura 4). Las dispersiones preparadas con SR-NOM han mostrado aglomerados de MWCNTs en la superficie de los organismos (Figura 4A), y la acumulación de nanotubos en su superficie externa constituye un mecanismo potencial de toxicidad. En el caso de las dispersiones con ácido húmico, se ha observado una gran cantidad de MWCNTs en el tracto digestivo de los organismos, dada su coloración oscura (Figura 4B). Sin embargo, los organismos expuestos a ácido húmico como sustancia blanco (Figura 4C) también han mostrado esta coloración. Este hecho podría suponer un mayor consumo de ácido húmico por las dafnias como fuente de alimento, y así explicar la reducción en la inmovilización con respecto a los MWCNTs dispersados en soluciones de SR-NOM.Por otra parte, los resultados obtenidos con SR-NOM han permitido observar el papel esencial que juega el diámetro exterior y el contenido de impurezas de los MWCNTs en su estabilidad y en su ecotoxicidad en dafnias. La materia orgánica natural del río Suwannee se ha considerado más apropiada para la evaluación ecotoxicológica de los MWCNTs, no sólo debido a la estabilidad proporcionada a las dispersiones, sino también a la capacidad de simular las condiciones reales en los sistemas acuáticos.Las Publicaciones 1 y 2 han presentado una optimización de las metodologías para preparar dispersiones acuosas para la evaluación de riesgos de los MWCNTs en organismos que representan a diferentes niveles tróficos, tales como bacterias (descomponedores) y crustáceos (consumidores primarios). Estos avances se han aprovechado para mejorar el conocimiento en la evaluación de riesgos de dos de los nanomateriales de óxidos metálicos más fabricados actualmente, las nanopartículas (NPs) de TiO2 y CeO2. Los datos publicados sobre su toxicidad acuática también son divergentes, lo cual supone una limitación para sus aplicaciones actuales y potenciales. La combinación de sus propiedades físico-químicas y las condiciones medioambientales también pueden dar lugar a su aglomeración o estabilización, determinando su biodisponibilidad y toxicidad.Dado que la SR-NOM ha sido seleccionada como una sustancia estabilizante adecuada y útil para los MWCNTs en la Publicaicón 2, la Publicación 3 se ha planteado como el siguiente paso hacia la demostración de su adecuación para la evaluación ecotoxicológica de los MNMs. Se han analizado las cinéticas de aglomeración y ecotoxicidad en Pseudokirchneriella subcapitata de las NPs de TiO2 y CeO2 en presencia y ausencia de SR-NOM. Estas algas verdes unicelulares se seleccionaron considerando su papel clave en los ecosistemas acuáticos (productores primarios en la cadena alimentaria). La materia orgánica natural del río Suwannee ha incrementado la estabilidad de las NPs en el medio de algas (Figura 5), mejorando la reproducibilidad de los resultados de los ensayos de toxicidad. Por otra parte, las cinéticas de aglomeración observadas en presencia de materia orgánica han sido similares a las publicadas previamente en diversas aguas subterráneas y de ríos. Además, la SR-NOM ha aliviado los efectos adversos de las NPs en el crecimiento de las algas, completamente en el caso de las NPs de TiO2 y parcialmente en las NPs de CeO2, lo cual sugiere un `camuflaje¿ de la toxicidad (Figura 6). Este comportamiento se ha observado también para otras especies de alga y tipos de materia orgánica natural en la bibliografía. Por tanto, la SR-NOM podría constituir una muestra representativa de la materia orgánica presente en diferentes ecosistemas, y el camuflaje de los efectos de las NPs de TiO2 y CeO2 en las células de algas podría considerarse como una interacción natural que tendría lugar en una evaluación ecotoxicológica estandarizada.