Analytical assays based on modulation of quantum dots in situ

Resumen

Esta tesis se centra en el estudio de la modulación del tamaño de nanopartículassemiconductoras y su aplicación al desarrollo de ensayos de fluorescencia,electroquímicos y fotoelectroquímicos. El trabajo se ha dividido en seis capítulos. Elprimero, consiste en una breve introducción sobre nanomateriales y su uso enbiodetección. Los siguientes cinco capítulos están basados en artículos presentados ypublicados en revistas científicas internacionales. Por último, la tesis termina con lasconclusiones, apéndices, una lista de mis publicaciones y agradecimientos.En el primer capítulo se introducen los términos de nanociencia y nanotecnologíay sus aplicaciones. La nanociencia es el estudio de estructuras y materiales en la escalananométrica. La nanotecnología es la manipulación de la materia en escala atómica,molecular y supramolecular. La nanociencia y nanotecnología tienen su origen en laconfluencia de materias como la química, biología, física, ciencia de materiales eingeniería. La nanoescala varía desde 100 nanómetros hasta el nivel atómico, dondeun nanómetro es la millonésima parte de un milímetro. Hoy en día, la nanotecnologíaes una de las áreas de mayor velocidad de crecimiento de la ciencia y la tecnología., enla que se ha hecho un progreso exponencial. Los usos actuales y potenciales de lananociencia y la nanotecnología abarcan una amplia gama de campos y podríandividirse en cuatro grandes categorías generales: nanometrología; tecnologíaelectrónica, nanomedicina y nanomateriales.El capítulo continúa describiendo los nanomateriales, en particular, nanopartículas(NPs) metálicas y semiconductoras. Las NPs son cristales de tamaño nanométrico,constituidos por moléculas orgánicas estabilizadoras y átomos de metal (Au, Ag,¿) osemiconductores (CdS, TiO2). Las NPs metálicas, especialmente las NPs de metalesnobles, como la plata, el oro, el plomo, etc., muestran características físicas, químicas ybiológicas características que las hacen altamente aplicables en el área terapéutica,sistema de administración de fármacos, en hipertermia / terapia fototérmica, imagenbiomédica, y biodetección.En comparación con las NPs metálicas, la principal ventaja de las NPssemiconductoras es su capacidad intrínseca de ser fotoexcitadas, y de emitir fotones2por la recombinación de parejas electron/agujero por lo que estas partículasfluorescentes se denominan en la literatura como puntos cuánticos (en inglés,quantum dots, QDs). Los QDs son cristales nanométricos de semiconductoresinorgánicos o nanocristales semiconductores con excelentes propiedades ópticas yelectrónicas en comparación con otros macro-objetos semiconductores. los QDpresentan algunas ventajas comparados con colorantes orgánicos fluorescentes:espectros de emisión gaussianos estrechos y ajustables en tamaño con un amplioancho de banda de excitación; los QD son excepcionalmente brillantes, debido a losaltos rendimientos cuánticos fluorescentes; de larga duración y mayor resistencia alfotoblanqueo; el rango de longitudes de onda es ajustable según el tamaño y los altoscoeficientes de extinción molar (~ 10-100 x de los colorantes orgánicos). Hay cuatrousos principales de los QDs: (1) visualización de células bajo iluminación continúa asícomo adquisición de imagen multi-color. (2) formación de imágenes de tejidosprofundos y para el rastreo de células cancerosas in vivo durante la metástasis; (3)marcadores fluorescentes en biodetección; (4) ensayos que emplean la transferenciade energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre QDs.Como se ha comentado anteriormente, los nanomateriales pueden serconvenientemente empleados en bioanálisis. Sin embargo, tales sistemas de ensayobasados en NPs presintetizadas se ven obstaculizados por la adsorción inespecífica deNPs decoradas con elementos de reconocimiento sobre superficies sólidas. Lossensores basados en FRET sufren una baja relación señal / ruido debido a unatenuamiento de la fluorescencia insuficiente entre las parejas donante/aceptor. Lageneración de NPs in situ producida por un evento de reconocimiento puede hacerfrente a estos inconvenientes. En la siguiente parte del primer capítulo se describen losmétodos bioanalíticos basados en la modulación enzimática de NPs, que son el objetoprincipal de esta tesis.El grupo del profesor Itamar Willner (Universidad Hebrea de Jerusalén) describiópor primera vez el crecimiento catalítico de NPs de oro in situ en presencia decofactores NAD(P)H. El desarrollo de dicho sistema introdujo nuevos ensayosenzimáticos sensibles y nuevas configuraciones de biosensores que emplean estímulosópticos, conductores o microgravimétricos como señales de lectura. Fuerondesarrollados diversos sistemas basados en el crecimiento catalítico de NPs metálicas3para el análisis de las actividades enzimáticas de lactato deshidrogenasa, glucosaoxidasa, alcohol deshidrogenasa o acetilcolina esterasa.Se ha descrito el crecimiento catalítico de NPs semiconductoras in situ quemejoran la sensibilidad de ensayos de detección analíticos. El beneficio principal deestos sistemas analíticos fue que las NPs semiconductoras fluorescentes crecidasenzimáticamente podían ser detectadas por espectroscopia de fluorescencia mássensible o fotoelectroquímica que mejora los límites de detección de los ensayos. Sedemostró que los iones sulfuro, productos tiolados u ortofosfatos generadosenzimáticamente podían interactuar con iones de cadmio añadidos exógenamentepara producir NPs de CdS esféricas. Se publicaron distintos ensayos para acetilcolinaesterasa, fosfatasa alcalina, S-adenosil-L-homocisteína hidrolasa y metionina gammaliasa,glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano picante, paraoxonasa sérica y glutatiónreductasa.El primer capítulo continúa con una breve descripción de los dispositivosbioanalíticos. Los nanomateriales se han convertido en componentes importantes enlos dispositivos bioanalíticos, ya que mejoran claramente los resultados en términos desensibilidad y límites de detección hasta la detección de moléculas individuales. Lascaracter¿sticas específicas de los nanomateriales, tales como las propiedades ópticas oelectrónicas, se han utilizado ampliamente para fabricar diferentes tipos debiosensores. La señal de lectura de estos dispositivos puede estar producida por elcambio en la intensidad o posición del pico de absorción óptica o espectros de emisiónde fluorescencia, resonancia de plasmón superficial (SPR), espectrometría Ramanamplificada por superfice (SERS) y potencial/corriente electroquímica. Existen variosgrupos diferentes de biosensores basados en nanomateriales, como SPR, SERS,fluorescencia, biosensores electroquímicos y fotoelectroquímicos.La sección final del primer capítulo incluye las principales hipótesis de la tesis: (1)la modulación de la forma de las CdS NPs en mezcla de reacción acuosas pueden serprovocadas por cantidades traza de analitos. (2) Los ensayos analíticos basados en lamodulación del crecimiento de NPs semiconductoras serán más sensibles que lospublicados previamente donde los iones S2- son generados en presencia de analitos.(3) Debido a las propiedades únicas de las CdS QDs, formadas en mezcla de ensayos,menos caras que la espectroscopía de UV-vis, la detección electroquímica y4fotoelectroquímica en vez de espectroscopía de fluorescencia puede ser aplicadapara el seguimiento de la formación de CdS QDs, haciendo los ensayos más rentablesy asequibles. Por tanto, esta tesis se centra en la modulación in situ de NPssemiconductoras (QDs) descubiertas por técnicas ópticas, electroquímicas yfotoelectroquímicas.El segundo capítulo de la tesis describe el estudio de las propiedadesfotocatalíticas de las NPs semiconductoras sintetizadas por medio de enzimas y suaplicación en la detección de actividades enzimáticas. Se demostró que las NPssemiconductoras de CdS (CdS NPs) producidas enzimáticamente son capaces decatalizar la oxidación del conocido sustrato enzimático cromógenico 3,3 ', 5,5' -tetrametilbenzidina (TMB) bajo luz UV. Estas NPs utilizan la energía de los fotones deluz UV y no requieren peróxido de hidrógeno para la oxidación de TMB. La tasa deoxidación fotocatalítica de TMB es directamente proporcional a la cantidad de CdS NPsproducidas in situ. Estas propiedades de las CdS NPs se aplicaron al desarrollo deensayos colorimétricos sensibles para la glucosa oxidasa (GOx) y la glutatión reductasa.Los ensayos cromogénicos desarrollados muestran una sensibilidad del mismo ordende magnitud o incluso mejor que la de los ensayos fluorogénicos correspondientes. Lametodología desarrollada abre la posibilidad de utilizar un sustrato común y baratocomo el TMB , como compuesto cromogénico universal para su empleo en ensayoscolorimétricos simples y sensibles de una serie de enzimas. El trabajo presentado eneste capítulo ha sido publicado: Ruta Grinyte, Gaizka Garai-Ibabe, Laura Saa, ValeriPavlov, Anal Chim Acta., 2015 Jun 30;881:131-8.El tercer capítulo de la tesis describe el proceso de ataque biocatalítico (en inglés,etching) de CdS NPs. Bajo acción de la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP) enpresencia de diferentes concentraciones de agua oxigenada (H2O2), se demostró ladisminución gradual del tamaño de las CdS NPs. Dicho fenómeno se comprobó por eldesplazamiento del pico de emisión hacia el azul (en inglés, blue-shift), la disminuciónde la intensidad de la fluorescencia y mediante imágenes de microscopía electrónicade transmisión (TEM). Por otro lado, se aplicó por primera vez este fenómeno para lamonotorización en tiempo real de la fotoluminiscencia durante el proceso de etchingde las CdS NPs. Para este experimento, la fluorescencia se midió inmovilizando las CdS5NPs sobre la superficie de microparticulas con la posterior adición de todos loscomponentes. La adquisición de imágenes de las CdS NPs durante el proceso deetching se realizó mediante microscopía de fluorescencia de campo amplio. Lapresente propuesta desarrollada podría encontrar una amplia gama de aplicaciones enquímica analítica y abrir un nuevo camino para la modificación y modulaciónenzimática de dispositivos bioelectrónicos basados en NPs de semiconductores. . Eltrabajo presentado en este capítulo ha sido publicado: Ruta Grinyte, Laura Saa, GaizkaGarai-Ibabe, Valeri Pavlov, Chem. Commun., 2015, 51, 17152-17155.En el cuarto capítulo de la tesis se desarrolla un nuevo inmunoensayo óptico yelectroquímico para la detección de marcadores tumorales como por ejemplo lasuperóxido dismutasa (SOD2) basándose en la generación enzimática in situ einmovilización de las CdS QDs sobre microparticulas. En dicho inmunoensayo, elanalito de interés (SOD2) media en la inmovilización del anticuerpo conjugado de lafosfatasa alcalina (ALP) sobre la superficie de las microparticulas de cloruro depolivinilo. La hidrólisis enzimática de para-nitrofenilfosfato por la ALP desencadena larápida formación de las CdS NPs estabilizadas con fosfato en la superficie de lasmicroparticulas. Para su detección se empleó la espectroscopia de fluorescencia yvoltametría de onda cuadrada (SWV). Estos nuevos inmunoensayos basados en ladetección electroquímica y fluorogénica empleando CdS NPs generadasenzimáticamente, proporcionan mejores límites de detección de al menos tresórdenes de magnitud en comparación con los métodos publicados anteriormente. Estametodología permitió la detección de SOD2 en lisados de células HepG2 (carcinomahepatocelular humano). El trabajo presentado en este capítulo ha sido publicado: RutaGrinyte, Javier Barroso, Marco Möler, Laura Saa, Valeri Pavlov, ACS Appl MaterInterfaces. 2016 oct DOI:10.1021/acsami.6b08362.El quinto capítulo de la tesis describe la modulación en el crecimiento de las CdSQDs estabilizadas con cisteína mediante agua oxigenada (H2O2) producidaenzimáticamente. El empleo de cisteína (CSH) como agente de recubrimiento posibilitala rápida formación de CdS QDs fluorescentes en soluciones acuosas a temperaturaambiente. Se demuestra que la oxidación del agente estabilizante mediante H2O2causa la disminución en la velocidad de formación in situ de las CdS NPs estabilizadas6con CSH a partir de los iones Cd2+ y S2-. Posteriormente, se combinó la modulación delcrecimiento de las CdS NPs estabilizadas con CSH con la oxidación biocatalítica de Dglucosa(glucosa) catalizada por la glucosa oxidasa (GOx), generándose H2O2 en lamezcla de reacción. La aplicación de este proceso biocatalítico para el desarrollo deensayos fluorométricos y fotoelectroquímicos (PEC) más sensibles y simples sirvió paradetectar la actividad de la enzima GOx en soluciones tampón y glucosa en muestrasreales de suero humano utilizando la actividad fotocatalítica de las QD producidas. . Eltrabajo presentado en este capítulo ha sido publicado: Ruta Grinyte, Javier Barroso,Laura Saa, Valeri Pavlov, 2016 nov DOI:10.1007/s12274-016-1378-1.Finalmente, en el último capítulo de la tesis se presenta la modulación en elcrecimiento de las CdS NPs mediante un proceso redox catalizado por iones de cobre(Cu2+). Los iones Cu2+ catalizan la oxidación de la CSH mediante oxígeno para modularel crecimiento de las CdS NPs estabilizadas con CSH. Este nuevo proceso químico seaplicó a la detección fluorogénica y fotoelectroquímica de los iones Cu2+ en muestrasreales de agua mineral y de grifo basándose en la actividad fotocatalítica de los NPsproducidas. Se demostró que los ensayos desarrollados no sufren interferencia conotros iones que acompañan a los iones Cu2+ y la sensibilidad se enmarca dentro dellímite estándar de la Unión Europea referente a los iones Cu2+ en agua potable. Eltrabajo presentado en este capítulo se encuentra en revisión en la siguiente revista:Ruta Grinyte, Javier Barroso, Laura Saa, Valeri Pavlov, Nano Letters.