Bases moleculares de la N-glicosilación en residuos de asparagina en eucariotas superiores y en residuos de arginina en enteropatógenos

Zusammenfassung

La N-glicosilación es una modificación post-traduccional llevada a cabo por un gran número de enzimas cuyos sustratos son también muy variados. Nuestros estudios se han centrado en la N-glicosilación de residuos de arginina, ya que queríamos entender el mecanismo de acción de los efectores de Salmonella enterica y sus ortólogos de E.coli EPEC/EHEC y Citrobacter rodentium. En cuanto a la N-glicosilación de residuos de asparagina en eucariotas superiores, se ha centrado en la actividad de la enzima FUT8, ya que es la única enzima responsable de la fucosilación central en N-glicoproteínas de mamíferos y a pesar de muchos años de investigación sobre FUT8, su mecanismo de reacción permanecía desconocido y el requisito de un GlcNAc terminal en el brazo α (1,3) del N-glicano para una fucosilación óptima no se entendía bien. Con nuestro estudio, hemos podido elucidar las bases moleculares de la especificidad de sustrato que presentan la familia de enzimas NleB/SseK, y que recae en un único residuo, variable entre los efectores SseK y NleB, y localizado en la interfaz del complejo NleB/SseK-sustrato. La mutación de dicho residuo (Ser286SseK1 o Asn302SseK2 a TyrNleB/NleB1), confiere a dichos mutantes la capacidad de alcanzar parámetros cinéticos y termodinámicos óptimos. Además, con esta mutación conseguimos hacer activos a los mutantes S286YSseK1 y N302YSseK2 frente a sustratos que no lo son originalmente en la SseK1 y SseK2 salvajes (FADD para SseK1 y DR3 para SseK2). Gracias a esto, también se le confiere al patógeno Salmonella una mayor supervivencia y proliferación en la infección de macrófagos. Esto ocurre ya que este residuo que mutamos, confiere estabilidad a la interacción entre el residuo aceptor del sustrato (un residuo de arginina) con la base catalítica. En general, nuestro estudio proporciona las bases moleculares de las diferencias entre la especificidad de sustrato de los efectores NleB/SseK y ofrece pistas sobre la patogénesis molecular de los enteropatógenos. En cuanto a la enzima FUT8, hemos conseguido determinar la estructura cristalina de un complejo ternario que nos ha permitido concluir que la enzima sufre grandes cambios conformacionales en presencia de los ligandos GDP/GDP-Fucosa y el N-glicano. Lo especial de estos cambios conformacionales, se debe a que el movimiento inducido por GDP y probablemente GDP-Fucosa trae los residuos que son necesarios para el reconocimiento de GDP-Fucosa/GDP y en parte G0 al sitio de unión. En cuanto a las características del N-glicano, lo llamativo es la conformación anti-ψ que adopta la estructura de la quitobiosa, que es más inestable que la conformación syn-ψ encontrada en disolución. El sitio de reconocimiento de los brazos terminales del N-glicano es un exositio formado por los loops β10-β11 y el dominio SH3. Los dominios SH3 son dominios pequeños que no cumplen una función catalítica dentro de la proteína, y se pueden encontrar en numerosas proteínas multidominio cuyas funciones pueden ser muy variadas. Además, con nuestro trabajo demostramos por primera vez que el dominio SH3 de FUT8 interacciona con glicanos, lo cual no se había visto anteriormente y es un hallazgo que demuestra que estos dominios puedes ser versátiles y reconocer otras moléculas diferentes a proteínas. La desregulación de FUT8 se relaciona con un gran número de diferentes patologías. Con la aplicación de nuestro estudio multidisciplinar hemos encontrado dos potenciales mecanismos que están detrás de las preferencias de sustrato de FUT8. En el primero, los residuos de los brazos α (1,3)/α (1,6) determinan el reconocimiento de FUT8 en N-glicanos complejos o N-glicanos ricos o más pobres en manosas, siendo los primeros los preferidos por la enzima. El segundo modulador de la fucosilación está impulsado por la naturaleza de los residuos del entorno del sitio de N-glicosilación. FUT8 reconoce los aminoácidos subyacentes y, en particular, el sequon OST. Este reconocimiento probablemente no sea importante en el proceso general de fucosilación en N-glicanos complejos, pero por el contrario, encontramos que el reconocimiento de péptidos es clave para la fucosilación de N-glicanos ricos o más pobres en manosas. Además, las interacciones mediante enlaces de hidrógeno e hidrofóbicas junto con los residuos no interaccionantes de la proteína, podrían bloquear la unión de FUT8 a los N-glicanos, impidiendo la fucosilación incluido en N-glicanos complejos.